骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，常被用作组织工程种子细胞^[1-2]。但由于其在机体内的数量极少，不能满足临床组织工程的需要。因此，如何建立高效快捷的体外大规模扩增技术已成为BMSCs应用中需要解决的重要问题。BMSCs体外扩增受到诸多因素的影响，其中最直接也是最重要的影响因素就是细胞所处的细胞外环境——培养基。培养基是细胞最直接的生存环境，不同的培养基成分组成存在差异，对细胞的生长分化能力存在一定影响。目前，用于大鼠BMSCs体外培养的培养基并不统一，主要有DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12。但关于不同培养基对大鼠BMSCs生长及形态影响的文献报道较少。本研究旨在探讨DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种不同培养基对大鼠BMSCs体外培养的影响，为满足临床和组织工程对BMSCs的需要提供实验数据。

1.   材料和方法

1.1   材料

1.1.1   实验动物

1月龄SPF级SD大鼠(雌雄不限)，由四川大学实验动物中心提供。

1.1.2   主要试剂

胎牛血清(FBS)、DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12培养基干粉购自HyClone公司，噻唑蓝(MTT)购自MCE公司，青霉素、链霉素购自索来宝公司，抗IgG、CD11b、CD45、CD90、CD29抗体购自BioLegend公司。完全培养基：分别在DMEM-LG、α-MEM和DMEM/F基础培养基中加15% FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素，制备成DMEM-LG完全培养基、α-MEM完全培养基和DMEM/F完全培养基。

1.1.3   实验仪器

酶标分析仪(Thermo Fisher Scientific)，CO₂培养箱(SANYO)，低温离心机(Thermo Fisher Scientific)，纯水仪(Milipore)，倒置显微镜(OLYMPUS)，血球计数板(上海求精)，流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)。

1.2   方法

1.2.1   大鼠BMSCs的分离培养

采用颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下分离股骨、胫骨，刮除肌肉、筋膜和骨膜，切除两端骨骺。用针筒吸取10 mL无血清培养液冲出骨髓，吹散细胞，2 000 r /min，离心10 min，用相应的完全培养基分别收集细胞，以2×10⁶ mL^-1的密度接种4 mL细胞悬液于25 cm²的培养瓶，置于37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度的CO₂孵箱，3 h后首次换液，以后每8 h换1次液。72 h后，每3~4 d换1次液，待原代细胞生长至65%~70%融合状态，用2.5 mg/mL胰蛋白酶消化传代。此后待细胞生长至80%~90%融合状态传代。

用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分别培养大鼠BMSCs，在倒置显微镜下观察细胞在第一代(P1)、第三代(P3)和第五代(P5)的形态。

1.2.2   不同培养基对大鼠BMSCs克隆形成的影响

分别用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离培养原代大鼠BMSCs，在倒置显微镜下观察细胞克隆形成的时间和数量。

1.2.3   不同培养基对大鼠BMSCs第一次传代时间的影响

分别用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离培养原代大鼠BMSCs，观察BMSCs达到第一次传代条件所需(即达65%~70%融合状态)的时间。

1.2.4   不同培养基对大鼠BMSCs增殖的影响

分别取用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离培养的P3代生长良好的BMSCs，2.5 mg/mL胰蛋白酶消化后，以6×10³ mL^-1接种于96孔板，每孔200 μL，每天用MTT法测定细胞增殖情况，连续9 d，以培养时间为横坐标，以光密度(OD)值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。另取一批细胞，以3×10⁴ mL^-1接种于12孔板，每种培养基3孔，72 h取样，用血球计数板计数细胞数量，计算P3代BMSCs扩增倍数。

扩增倍数=n代收获的细胞数/n代接种的细胞数

1.2.5   不同培养基对大鼠BMSCs贴壁的影响

分别取用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离培养的P3代BMSCs (在细胞培养瓶中长至70%~80%的融合状态)，用2.5 mg/mL胰蛋白酶消化，以1×10⁵ mL^-1浓度接种于6孔板中, 每孔2 mL，置于37 ℃、饱和湿度的CO₂培养箱中；2 h后，用2.5 mg/mL胰蛋白酶消化细胞并计算贴壁率〔贴壁率(%)＝贴壁细胞数/接种细胞数×100%〕，并以时间为横坐标，以贴壁率为纵坐标绘制贴壁率曲线。

1.2.6   大鼠BMSCs的表面抗原鉴定

分别取用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离培养的P3代BMSCs，用2.5 mg/mL胰酶消化，收集所有细胞，每管细胞数量≥5×10⁵个，用常温PBS洗涤2次，分别加入IgG、CD11b、CD45、CD90、CD29抗体孵育30 min，常温PBS洗涤2次，上流式细胞仪检测。

1.2.7   统计学方法

所有数据计量资料用x±s表示。各组组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   不同培养基对大鼠BMSCs形态的影响

如图 1所示，观察用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12完全培养基分别培养的P1、P3和P5大鼠BMSCs发现，P1大鼠BMSCs均表现出形态不均一；当培养至P3时，大鼠BMSCs的形态均一化程度均有所提高，但DMEM-LG完全培养基培养的大鼠BMSCs的形态均一化程度高于α-MEM、DMEM/F12完全培养基培养的BMSCs；而α-MEM、DMEM/F12完全培养基培养的细胞至第5代时，细胞形态才比较均一。提示，DMEM-LG完全培养基更有利于大鼠BMSCs形态的均一化程度。

图  1  不同培养基对大鼠BMSCs形态的影响。×40

Figure  1.  The effect of different media on morphology of rat BMSCs. ×40

A: DMEM-LG; B:α-MEM; C: DMEM/F12

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2.2   不同培养基对大鼠BMSCs克隆形成的影响

见图 2。用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12完全培养基分别培养原代大鼠BMSCs，观察细胞克隆形成的时间和数量。结果显示，DMEM-LG完全培养基分离培养的大鼠BMSCs形成细胞克隆的平均时间为(7.7±1.5) d，短于用α-MEM、DMEM/F12完全培养基分离培养者〔(10.7±2.1) d和(13.7±2.1) d〕，差异有统计学意义(P < 0.01)，而后两者的比较，差异也有统计学意义(P < 0.05)。同时，在培养14 d时，对细胞克隆计数发现，DMEM-LG完全培养基分离培养的大鼠BMSCs形成的细胞克隆数为(14±2)个，高于用α-MEM、DMEM/F12完全培养基分离培养者〔(10±1)个和(6±1)个〕，差异有统计学意义(P < 0.01)，而后两者的比较，差异也有统计学意义(P < 0.05)。

图  2  不同培养基对大鼠BMSCs克隆形成数量的影响。×40

Figure  2.  The effect of different media on the number of clone formation of rat BMSCs. ×40

Primary rat BMSCs were cultured in DMEM-LG (A), α-MEM (B) and DMEM/F12 (C)

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2.3   不同培养基对大鼠BMSCs第一次传代时间和增殖的影响

分别用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离大鼠BMSCs，结果显示，DMEM-LG完全培养基分离培养的大鼠BMSCs在(11.00±1.11) d达到首次传代的融合状态(65%~70%)，可进行传代。而用α-MEM、DMEM/F12完全培养基分离培养的大鼠BMSCs分别在(14.00±1.25) d和(17.00±1.67) d才达到首次传代的融合状态。而对DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分别培养的P3代生长良好的BMSCs进行细胞生长曲线观察发现(图 3)，大鼠BMSCs的生长曲线基本为S型，细胞接种后1~3 d内，OD值逐渐上升，细胞缓慢增殖；3 d后，OD值快速升高，细胞增殖加速。DMEM-LG完全培养基分离培养的BMSCs在第4天进入对数生长期，第6天达到峰值，此时细胞铺满整个培养孔底面的大部分区域，细胞生长曲线显示BMSCs生长进入一个平台期；到第9天时，OD值开始降低，细胞生长曲线显示细胞正在退化衰亡。而用α-MEM、DMEM/F12完全培养基分离培养的大鼠BMSCs至第6天进入对数生长期，第7天和第8天达到峰值。同时，对DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分别培养的P3代生长良好的BMSCs进行3 d扩增计数发现，DMEM-LG完全培养基分离培养的BMSCs平均扩增倍数为6.67±1.60，细胞计数达(2.5~3.0)×10⁵ mL^-1，3 d总扩增数量达(2.2~2.7)×10⁵ mL^-1，而α-MEM、DMEM/F12完全培养基分离培养的大鼠BMSCs扩增倍数分别5.67±1.46、5.20±1.43，细胞计数分别为(1.5~1.7)×10⁵ mL^-1、(1.5~1.6)×10⁵ mL^-1，3 d总扩增数量分别为(1.2~1.4)×10⁵ mL^-1、(1.2~1.3)×10⁵ mL^-1。以上结果表明，DMEM-LG完全培养基培养的大鼠BMSCs进入对数生长期时间短，细胞扩增倍数大, 单位时间内细胞扩增数量多, DMEM-LG完全培养基更有利于大鼠BMSCs的增殖。

图  3  不同培养基对大鼠BMSCs增殖的影响

Figure  3.  The effect of different media on the proliferation of rat BMSCs

* P < 0.05, **P < 0.01, vs. DMEM/F12 at the same time point; #P < 0.05, ## P < 0.01, vs. α-MEM at the same time point

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2.4   不同培养基对大鼠BMSCs贴壁的影响

分别用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种完全培养基分离培养大鼠BMSCs，观察大鼠BMSCs贴壁情况。DMEM-LG完全培养基分离培养的大鼠BMSCs，2 h后贴壁率达(47.0±2.8)%，而用α-MEM、DMEM/F12完全培养基分离培养的大鼠BMSCs 2 h后贴壁率分别为(27.6±2.0)%和(17.3±1.4)%，该结果表明，DMEM-LG完全培养基促进大鼠BMSCs贴壁的能力强于α-MEM(P < 0.05)、DMEM/F12完全培养基(P < 0.05)。

2.5   不同培养基对大鼠BMSCs的表面抗原的影响

DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12培养基培养的P3代大鼠BMSCs均高表达CD90、CD29，其中CD90表达阳性率分别为97.5%、97.3%和97.0%，CD29表达阳性率分别为96.8%、96.6%和95.9%，并低表达CD11b/c、CD45, 其中CD11b/c表达阳性率分别为1.5%、1.9%和2.9%，CD45表达阳性率分别为4.6%、7.2%和8.6%(图 4)。结果显示，DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12培养基对大鼠BMSCs表面抗原的表达无明显影响。

图  4  DMEM-LG, α-MEM and DMEM/F12分别培养的BMSCs表面抗原测定

Figure  4.  The immunophenotypes of BMSCs cultured in DMEM-LG, α-MEM and DMEM/F12 were analyzed by flow cytometry

Cells were positive for CD90, CD44, but negative for CD11b/c, CD45

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3.   讨论

BMSCs在体外培养和扩增是其在临床和组织工程中应用的基础。通过寻求BMSCs体外培养的合适的环境，能使BMSCs在短时间内得到较高的扩增倍数，得到较多数量的细胞；从而满足临床和组织工程的需要。在诸多影响因素中，培养基是构成细胞体外生存环境最直接的因素。因此，寻求最适合BMSCs生长的培养基的重要性不言而喻。目前用于BMSCs体外培养的培养基主要有以下3种：DMEM-LG、α-MEM和DMEM/F12培养基。不同的培养基其成分组成存在差异。近年来，有研究报道了不同的培养基对BMSCs的影响，但结果并不十分统一^[3-5]。本研究主要探讨DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12培养基对大鼠BMSCs生长和增殖的影响差异，结果显示，以DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12分别培养大鼠BMSCs，其细胞形态、克隆形成时间、克隆形成数量、第1次传代的时间、以及相同条件下贴壁率以及生长曲线和扩增倍数、单位时间内扩增数量都存在差异。其中，DMEM-LG培养基培养的大鼠BMSCs形态比较均一，在P3、P5代均一程度均优于其它两组；克隆形成时间最短，14 d克隆形成数量最多，第1次传代的时间也最短。在相同培养条件下，DMEM-LG培养基培养的大鼠BMSCs贴壁率最高，进入对数生长期耗时最短，扩增倍数和3 d总扩增数量最高。有研究表明，进行体外细胞培养时，血清(包括各类蛋白和贴附因子)^[5-6]、二价阳离子^[7-8]、贴壁介质表面特性^[9-11]和培养基pH值^[12]等构成影响细胞贴壁的重要因素。其中，培养基pH在诸多因素中显得尤为重要，其对大鼠BMSCs的扩增、分化、成熟以及功能特性的影响较为明显。研究发现DMEM-LG和DMEM/F12的pH值相差0.2~0.3，在加入相同碳酸氢钠情况下，DMEM/F12的pH值明显偏碱，对体外培养大鼠BMSCs的增殖造成不利影响^[13-14]。同时，高浓度葡萄糖对细胞的生长也产生不利影响，因为高浓度葡萄糖代谢产生的乳酸较多，从而令干细胞增殖所需的微环境受到较高酸性代谢产物的影响，破坏细胞的生长环境，最终抑制细胞的生长^[15]。TENNANT等^[16]研究也发现较低浓度的葡萄糖能减少细胞的调亡，有利于细胞的增殖和集落形成。本研究中DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12培养基中葡萄糖质量浓度分别为1 000、1 000、3 151 mg/L，这可能是造成细胞集落形成和生长速度差异的原因之一。此外，培养基中谷氨酰胺对细胞的生长也至关重要，谷氨酰胺缺乏会导致细胞营养不良，甚至死亡^[17-18]。在DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种培养基中，DMEM-LG培养基中谷氨酰胺浓度(584 mg/L)高于α-MEM(292 mg/L)以及DMEM/F12(365 mg/L)培养基，从而有利于细胞的生长和增殖。本研究结果表明，在DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种培养基中，DMEM-LG是较适合大鼠BMSCs生长的培养基。