子宫颈癌(简称宫颈癌)是女性最常见的妇科恶性肿瘤。近年不断发展的人类基因组学及肿瘤分子生物学使精准医疗、靶向治疗成为恶性肿瘤诊治的研究重点。国内外已有研究发现^[1-6]高迁移率核小体蛋白N2(HMGN2)在口腔鳞癌、肺癌、骨肉瘤方面的抗肿瘤作用，但抗宫颈癌方面研究尚无，本课题前期发现^[7]HMGN2可通过阻滞肿瘤细胞于S期从而抑制SiHa细胞增殖、促进其凋亡，并能抑制小鼠体内的宫颈癌HeLa细胞移植瘤，提示HMGN2有抗宫颈癌作用。另一方面，CyclinD1是细胞周期G₁/S期的调控蛋白，细胞周期素依赖激酶抑制剂(CDKIs)已作为肿瘤靶向治疗药物之一参与临床试验，可用于伴有细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白过表达的肿瘤靶向治疗；从细胞周期调控的机制上看，两种蛋白在细胞周期G₁/S期有正负调节作用。因此，本实验检测HMGN2、CyclinD1在人正常宫颈组织、CIN、宫颈癌组织中的阳性表达，探讨其与宫颈癌的临床病理特征的关系，为宫颈癌的分子标记及靶向治疗找寻新证据。

1.   对象与方法

1.1   研究对象

选取四川大学华西第二医院病理科2014年7月至2015年9月临床病理资料完整的石蜡标本。20例正常宫颈组织，患者年龄42~53岁，均因子宫良性病变行子宫全切术，术后宫颈标本病理证实诊断。30例CIN，患者年龄34~55岁，均因CIN行宫颈锥切术或子宫全切术，术后病理诊断证实为CINⅡ、CINⅢ或/并累腺。50例宫颈癌，患者年龄33~65岁，按照国际妇产科联盟(FIGO，2009)宫颈癌临床分期，ⅠA2期3例，ⅠB1期30例，ⅠB2期7例，ⅡA1期10例；参照WHO肿瘤组织学分类：腺鳞癌8例，鳞癌34例，腺癌8例(微偏腺癌1例)；病理诊断：高分化8例，中分化12例，低分化30例；癌灶浸润宫颈间质全层者10例，＞1/2全层者15例，＜1/2全层者25例；癌周脉管内查见有癌栓者27例；有盆腔淋巴结转移者6例(盆腔淋巴结转移1枚者3例，2枚者1例，4枚者1例，6枚者1例)，均无腹主动脉旁淋巴结转移。所有病理诊断均由病理科专家核实。

1.2   免疫组化检测HMGN2和CyclinD1的表达

采用常规免疫组化SP法，主要试剂为Anti-HMGN2 antibody (稀释1:100，美国Abcam公司)、CyclinD1 (92G2) Rabbit mAb (稀释1:100, 上海优维宁生物科技有限公司)；用已知CyclinD1表达阳性的乳腺癌切片及HMGN2表达阳性的口腔上皮切片作为阳性对照；PBS代替一抗染色后的组织切片作为阴性对照。

1.3   结果判定标准

HMGN2主要表达于细胞核，CyclinD1主要表达于细胞浆，两种标记物的阳性信号主要表现为棕黄色、棕褐色颗粒。使用OLMPUS光学显微镜、Image-Pro Plus 6.0软件，由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法分别观察，采用二级计分法，高倍镜(×400)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，按阳性细胞所占比例及着色强度计分：①阳性细胞比例：≤10%计0分，11%~25%计1分，26%~50%计2分，＞50%计3分；②着色强度：未着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色2分，棕褐色3分。最后将以上两种计分方式所得结果相加，综合计分＜2分为阴性表达，≥2分则为阳性表达。

1.4   统计学方法

样本率之间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。两分类变量之间关联性分析采用Pearson列联系数评价，α=0.05。

2.   结果

2.1   HMGN2、CyclinD1在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌中的表达

正常宫颈组织中HMGN2阳性表达18例，阳性率90.00%，CIN组织中HMGN2阳性表达21例，阳性率70.00%，宫颈癌组织中HMGN2阳性表达22例，阳性率44.00%，三组之间阳性表达率差异有统计学意义(χ²=6.23，P＜0.05)。

正常宫颈组的CyclinD1阳性表达6例，阳性率30.00%，CIN组的CyclinD1阳性表达17例，阳性率56.67%，宫颈癌组的CyclinD1阳性表达32例，阳性率64.00%，3组之间阳性率差异有统计学意义(χ²=6.72，P＜0.05)。

2.2   宫颈癌的HMGN2表达与临床病理特征的关系

宫颈癌组织HMGN2的阳性表达与病理类型、宫颈间质浸润深度、有无脉管浸润、FIGO分期(Ⅰ/Ⅱ期)、有无淋巴结转移无关(各组间差异无统计学意义)，但与宫颈癌分化程度有关(χ²=8.71，P＜0.025)。见附表。

  附表  宫颈癌HMGN2表达与临床病理特征的关系

临床病理特征	n	HMGN2表达/例数(%)		P	CyclinD1表达/例数(%)		P
		阳性	阴性		阳性	阴性
病理类型				＞0.05			＞0.05
鳞癌	34	13(38.2)	21(61.8)		25(73.5)	9(26.5)
腺癌	8	3(37.5)	5(62.5)		3(37.5)	5(62.5)
腺鳞癌	8	6(75.0)	2(25.0)		4(50.0)	4(50.0)
分化程度				＜0.025			＞0.05
高分化	8	7(87.5)	1(12.5)		3(37.5)	5(62.5)
中分化	12	6(50.0)	6(50.0)		10(83.3)	2(16.7)
低分化	30	9(30.0)	21(70.0)		19(63.3)	11(36.7)
宫颈间质浸润深度				＞0.05			＞0.05
＜1/2	25	11(44.0)	14(56.0)		16(64.0)	9(36.0)
＞1/2	15	7(46.7)	8(53.3)		9(60.0)	6(40.0)
全层	10	5(50.0)	5(50.0)		7(70.0)	3(30.0)
FIGO分期				＞0.05			＞0.05
Ⅰ期	40	19(47.5)	21(52.5)		28(70.0)	12(30.0)
Ⅱ期	10	3(30.0)	7(70.0)		4(40.0)	6(60.0)
脉管浸润				＞0.05			＞0.05
有	27	15(55.6)	12(44.4)		18(66.7)	9(33.3)
无	23	7(30.4)	16(69.6)		14(60.9)	9(39.1)
淋巴转移				＞0.05			＞0.05
有	6	4(66.7)	2(33.3)		5(83.3)	1(16.7)
无	44	18(40.9)	26(59.1)		27(61.4)	17(38.6)

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2.3   宫颈癌的CyclinD1表达与临床病理特征的关系

宫颈癌组织CyclinD1的阳性表达与病理类型、分化程度、间质浸润深度、有无脉管浸润、FIGO分期、有无淋巴结转移均无关，各组间差异无统计学意义。见附表。

2.4   HMGN2与CycinD1在宫颈癌中的联合表达

本实验选取正常宫颈组织、CIN、宫颈癌共100例标本中，HMGN2表达阳性共计61例，阴性39例，CycinD1表达阳性共计55例，阴性45例，两者同时表达阳性者40例，同时表达阴性者24例，HMGN2表达阳性与CycinD1表达阳性低度相关(χ²=7.07，P＜0.01，Pearson列联系数0.26)。

3.   讨论

HMGN2具有参与机体免疫反应、抗菌活性、抗肿瘤等作用^[1-2]。PORKKA等^[3]研究发现HMGN2蛋白C端的α螺旋结构可以通过影响DNA转录以抑制蛋白质合成，从而诱导肿瘤细胞凋亡，并且不影响正常宫颈上皮细胞。ISOAI等^[4]发现浸润抑制因子2(invasion inhibiting factor 2，IIF2)可以抑制小鼠体内肺癌肿瘤细胞的迁移，而IIF2与HMGN2蛋白C端结构极其相似；LIANG等^[5]在细胞及动物实验中均发现：当HMGN2蛋白表达增高时，骨肉瘤细胞的迁移及增殖能力会被抑制。XIONG等^[6]筛选出一种多肽，不仅可以与肿瘤细胞特异性相结合，而且能进入肿瘤细胞的胞核内部，它的结构与HMGN2蛋白的N端结构十分相近，在植入了Hela细胞的小鼠体内实验中，发现和细胞毒相结合后的HMGN2可以使小鼠体内的肿瘤明显缩小。以上这些研究证明HMGN2蛋白的C端除抗肿瘤增殖、抑制肿瘤细胞的转移外，N端还可以携细胞毒药物进入肿瘤细胞，这也是HMGN2蛋白可以在恶性肿瘤的靶向治疗中应用的重要依据。

本课题前期发现^[7]HMGN2蛋白能阻滞宫颈癌SiHa细胞于S期，并随着HMGN2蛋白质量浓度的增加，S期的细胞逐渐增多，证实HMGN2蛋白对SiHa细胞具有抑制作用；同时又在动物体内证实：HMGN2对裸鼠体内的宫颈癌HeLa细胞移植瘤有较强的抗增殖作用。本实验从免疫组化的角度初步发现宫颈癌的HMGN2蛋白阳性表达率低于CIN及正常宫颈组织，HMGN2阳性表达率与宫颈癌分化程度有关，提示HMGN2蛋白低表达也许会引起正常宫颈的上皮细胞生长分化异常，从而参与宫颈上皮从CIN到宫颈癌变的进展过程。综上，为HMGN2蛋白在宫颈癌靶向治疗上增加了证据。

CyclinD1通过促细胞周期G₁/S期转换而发挥自身调控作用，使细胞开始不断分裂或转化^[8]。在正常情况下，CyclinD1蛋白仅仅一过性存在于细胞周期中，若某些因素导致该蛋白过表达，则会使细胞不断地异常增殖，最终导致肿瘤形成。CyclinD1蛋白与宫颈癌的关系也是近年研究热点，CyclinD1蛋白能否作为提示宫颈癌的预后因素却结论不一。近十几年来，宫颈癌筛查手段已得到广泛普及，宫颈癌的诊断率也已得到极大的提高，但早期尤其是内生型宫颈癌因临床表现不典型、阴道镜检不满意，使得宫颈癌有一定漏诊率。本实验发现CIN和宫颈癌中CyclinD1蛋白过表达率高于正常组，这和该蛋白所参与细胞周期调控作用、异常过表达所致细胞异常连续增殖的细胞周期学说理论一致，提示CyclinD1可能是宫颈癌早期诊断的分子标记，若能将其与现有的宫颈癌筛查手段相结合，可能有助于宫颈癌的早期诊断。

恶性肿瘤的本质就是一种细胞周期异常所致的疾病，细胞周期的调控失常才使肿瘤细胞持续性增殖，在细胞的正常调控中，G₁/S期是细胞内外信号传递和细胞增殖的关键调控环节^[9]。目前认为HMGN2蛋白可能作为一种抑癌基因在生理情况下促进组织器官的分化，而在肿瘤中又可以阻滞肿瘤细胞停滞于S期，通过促肿瘤细胞凋亡而发挥自身的抗肿瘤作用，说明HMGN2蛋白与细胞周期G₁/S期调控密切相关。而CyclinD1蛋白通过促使细胞不断向G₁/S期转换而使细胞持续分裂而最终致瘤。以上提示HMHN2与CyclinD1这组蛋白在细胞G₁/S期起着相反的调控作用。LIANG等^[5]曾用HMGN2转染SaO₂和U₂-OS细胞系，发现HMGN2可以抑制骨肉瘤细胞增殖，并且HMGN2表达增强伴随着CyclinD1蛋白表达减少。

HMGN2作为一种抑癌基因，当某种因素导致正常宫颈组织中的HMGN2蛋白低表达，无法发挥其正常作用时，宫颈上皮细胞正常分化能力失调，若同时存在某种因素导致的CyclinD1蛋白过表达，则宫颈上皮细胞不断异常增殖从而发展为癌，因此，HMGN2低表达及CyclinD1过表达可能在细胞周期调控失常的环节共同参与了宫颈癌的进展过程。本实验发现HMGN2低表达与CyclinD1过表达之间列联系数为0.26，提示两者相关程度低，应首先扩大样本量，找寻HMGN2、CyclinD1的表达关系，若证实后可进一步在细胞学、动物学实验方面研究HMGN2及CKDIs是否具有联合抗宫颈癌的作用。