脂肪酸合成增强是肿瘤细胞的一个标志性代谢改变。脂肪酸是合成膜磷脂的基本原料，能为肿瘤细胞提供能量支持，还用于生成一系列促癌脂质信号分子，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用^[1]。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1)是催化饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)形成单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)的关键酶，是脂肪酸合成途径中最终步骤的限速酶^[1]。SCD1的产物棕榈油酸(C16:1)和油酸(C18:1)是磷脂、胆固醇酯和中性脂质的重要组成成分。调控SCD1表达水平和活性不仅影响细胞膜结构的合成和功能，而且影响机体的脂质代谢。近年来研究发现，SCD1参与肺癌、肾癌等多种肿瘤的发生发展^[2-3]。乳腺癌是目前全世界女性癌症相关死亡的主要原因^[4]。流行病学研究表明，肥胖不仅是乳腺癌的危险因素，还与不良预后相关^[5-6]，乳腺癌的发生发展与机体脂代谢密切相关。然而，有关乳腺癌SCD1的研究却鲜有报道。我们的前期研究发现SCD1在乳腺癌组织中表达水平显著升高^[7]。抑制SCD1的表达有可能成为治疗乳腺癌的新途径。本研究应用SCD1特异性的小分子抑制剂MF-438干预乳腺癌细胞，分析抑制SCD1的活性对乳腺癌细胞增殖和细胞周期的影响，并探讨其可能机制，为SCD1作为乳腺癌治疗的新靶标提供依据。

1.   材料与方法

1.1   主要试剂

SCD1抑制剂MF-438购自德国Merck Millipore公司，DMSO购自北京Solarbio公司，CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)试剂盒购自美国Promega公司，Propidium iodide staining (PI)购自美国Sigma公司，SCD1、Cyclin D1小鼠单克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Akt兔多克隆抗体、pAkt (Ser473)兔单克隆抗体、pAMPKα (Thr172)兔多克隆抗体、pACC (Ser79)兔多克隆抗体均购自美国Cell Signal Technology公司，β-actin小鼠单克隆抗体购自美国Signalway Antibody公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2   细胞及培养

人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株和正常人皮肤成纤维细胞株HSF细胞为河北省人民医院临床医学研究中心保存。使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI-1640培养基，37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，实验时采用2% FBS的培养基培养。MF-438应用DMSO配制成10 mmol/L，使用时用培养基稀释为所需浓度。

1.3   MTS法检测SCD1抑制剂对细胞增殖的影响

将MCF-7细胞和HSF细胞以10⁴ /孔密度接种于96孔板，2%FBS的RPMI-1640培养24 h后，同时以10%FBS的RPMI-1640培养作对照，再用100 nmol/L~100 μmol/L MF-438或对照DMSO干预细胞48 h，使用MTS法，加入20 μL/孔CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent，在37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中孵育1 h，使用酶标仪检测490 nm的吸光度值(A₄₉₀)测定细胞活性。

1.4   细胞周期分析

MCF-7细胞接种于25 cm²培养瓶，2%FBS的RPMI-1640培养24 h后，加入5 μmol/L MF-438或对照DMSO，作用48 h后弃培养液，0.25%胰酶消化贴壁细胞，单细胞悬液约(1~5)×10⁶ mL^-1，4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心去PBS，加入4 ℃预冷的70%乙醇固定2 h，PBS洗1次，然后重悬，加入PI(50 μg/mL)+ RNase A(100 μg/mL)+ Triton X-100(0.2%)，室温避光30 min后流式细胞仪检测细胞周期。

1.5   蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达

取MCF-7、MDA-MB-231和HSF细胞，以及经5 μmol/L MF-438干预48 h后的MCF-7细胞，用细胞裂解液提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将凝胶上的目的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉的TBST液封闭PVDF膜2 h，分别加入一抗SCD1和Cyclin D1(工作液稀释浓度1:200)，Akt、pAkt、pAMPK和pACC(工作液稀释浓度1:1 000)或β-actin(作为内参, 工作液稀释浓度1:3 000) 4 ℃摇床孵育过夜，加入二抗(稀释浓度1:10 000)，室温反应2 h；将发光液均匀地滴在PVDF膜的蛋白面上，出现明显荧光条带后，依次压片、曝光、显影和定影。将X线胶片于凝胶成像系统照像，Image J v1.8软件进行分析。结果用目的蛋白条带的IOD值与β-actin条带的IOD值的比值表示。

1.6   统计学方法

数据结果以x±s表示。两个样本均数比较用t检验，应用χ²检验和单因素方差分析进行组间比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   SCD1在乳腺癌细胞及HSF细胞中的表达

蛋白质印迹结果(图 1)显示，SCD1在乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞中的表达分别为1.13±0.03、0.95±0.04，高于正常人皮肤成纤维细胞HSF的表达(0.34±0.02)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图  1  SCD1在乳腺癌细胞及皮肤成纤维细胞中的表达

Figure  1.  Expression of SCD1 in breast cancer cell lines and human skin fibroblasts cells

*P < 0.05, vs. HSF cells

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   SCD1抑制剂对MCF-7细胞和HSF细胞的增殖抑制作用

MTS结果显示(图 2)，不论是在10%还是在2%FBS培养条件下，与DMSO对照相比，在100 nmol/L~100 μmol/L浓度范围内，MF-438对MCF-7细胞显示出显著的剂量依赖性增殖抑制作用，即MCF-7细胞增殖活性随MF-438浓度增加而降低。在2%FBS条件下，MF-438作用的IC₅₀为(3.9±0.45)μmol/L，在10%FBS条件下，IC₅₀为(18.6±0.35)μmol/L。这表明，在低血清浓度下生长的MCF-7细胞对SCD1抑制剂的生长抑制作用更为敏感。在10%FBS条件下，MF-438并未对正常HSF细胞产生明显的生长抑制作用。

图  2  SCD1抑制剂对乳腺癌MCF-7细胞和人皮肤成纤维细胞HSF细胞增殖的影响

Figure  2.  Anti-proliferation of SCD1 inhibitor in MCF-7 cells and HSF cells

* P < 0.05, vs. 10%FBS MCF-7

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   SCD1抑制剂对乳腺癌细胞周期的影响

2.3.1   SCD1抑制剂对细胞周期的阻滞作用

结果显示(图 3)，与DMSO对照组相比，MF-438作用下，S期(对照44.8% vs. MF-438 35.3%，P=0.001)和G₂/M期(对照4.9% vs. MF-438 2.6%，P=0.003)细胞比例减少，G₀/G₁期(对照50.4% vs. MF-438 62.1%，P=0.001)细胞比例增加，差异均有统计学意义(P < 0.05)。这表明SCD1抑制主要阻断了细胞周期中的合成期(S期)，使大量细胞被阻滞在G₀/G₁期。

图  3  SCD1抑制剂对MCF-7细胞周期的阻滞作用

Figure  3.  The effect of SCD1 inhibition on the cell cycle in MCF-7 cells

*P < 0.05, vs. DMSO control in all the cell cycle phases

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3.2   SCD1抑制剂对细胞周期相关蛋白表达的影响

蛋白质印迹法检测结果显示(图 4)，5 μmol/L MF-438作用于MCF-7细胞48 h，与DMSO对照组相比，Cyclin D1的表达水平降低，降低约60%，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图  4  SCD1抑制剂下调Cyclin D1的表达

Figure  4.  Inhibition of SCD1 downregulates Cyclin D1 expression

* P < 0.01, vs. DMSO control

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   SCD1抑制剂对Akt通路和AMPK通路的影响

2.4.1   SCD1抑制剂对细胞磷酸化Akt(pAkt)水平的影响

结果显示(图 5)，用5 μmol/L SCD1抑制剂MF-438作用MCF-7细胞48 h后，与DMSO对照组相比，pAkt的表达水平下降，pAkt/Akt的比值降低约59%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图  5  SCD1抑制剂下调pAkt的表达

Figure  5.  Inhibition of SCD1 decreases Akt phosphorylation

* P < 0.05, vs. DMSO control

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4.2   SCD1抑制剂对磷酸化AMPK(pAMPK)和ACC活性的影响

如图 6所示，用5 μmol/L SCD1抑制剂MF-438作用MCF-7细胞48 h后，与对照组相比，pAMPK水平升高约65%，同时磷酸化ACC(pACC)水平增加约74%，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明抑制SCD1活性能有效的诱导AMPK磷酸化活化，从而使ACC失活，下调脂肪酸合成。

图  6  SCD1抑制剂上调pAMPK的表达抑制ACC活性

Figure  6.  Inhibition of SCD1 upregulates AMPK phosphorylation and then reduces ACC activity

* P < 0.05, vs. DMSO control

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

乳腺癌的形成、增殖和转移是多基因、多因素共同作用的结果。除了遗传、年龄、月经史、婚育史等已知具有确定性的危险因素外，流行病学研究表明，乳腺癌的发生发展与机体脂代谢密切相关^{[6, 8]}。新细胞膜的形成是肿瘤细胞生长和增殖的必要条件，脂质双分子层是构成细胞膜的基本支架。MUFA是生物膜结构的主要成分，通过酰化作用生成以磷脂质为主的膜脂质，MUFA在肿瘤细胞的膜结构和功能中发挥着重要作用。SCD1是催化SFA第9位碳链形成n-9系MUFA的关键酶Δ9脂肪酸去饱和酶，是催化SFA转化为MUFA的关键酶^[9]。近年来研究显示，SCD1在肺癌、结肠癌、肾癌组织中高表达并参与肿瘤形成和发展。本研究结果显示，SCD1在两种乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中均高表达，而在人皮肤成纤维细胞HSF中低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明针对SCD1的抗肿瘤治疗具有一定靶向性。本研究应用SCD1的特异性小分子抑制剂MF-438干预人乳腺癌MCF-7细胞，抑制其SCD1的活性和功能，结果显示，MF-438在100 nmol/L~100 μmol/L浓度范围内对MCF-7细胞显示出显著的剂量依赖性的增殖抑制作用，IC₅₀值仅为(3.9±0.45) μmol/L。表明抑制SCD1活性对MCF-7细胞有显著的生长抑制作用。

流式细胞术检测结果显示，SCD1抑制剂干预乳腺癌MCF-7细胞后，处于细胞分裂周期的S期和G₂/M期的细胞比例显著减少，G₀/G₁期细胞比例增加，说明抑制SCD1的活性能阻滞MCF-7细胞周期于G₀/G₁期，使其停止分裂增殖。事实上，细胞增殖过程中膜磷脂的合成和转换主要发生于细胞周期的G₁期和早S期^[10]，而MUFA是膜脂质的主要成分，故细胞增殖周期的早期阶段需要MUFA合成参与，这也表明抑制SCD1导致产物MUFA缺乏从而引起细胞周期阻滞的发生。CyclinD1即G1/S-特异性周期蛋白-D1，调控着G₁期特有的细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs，推动细胞周期由G₁期进入到S期，促进细胞增殖。本研究显示MF-438干预MCF-7细胞后，Cyclin D1的表达水平显著降低，表明SCD1抑制剂的抗肿瘤作用与阻滞乳腺癌细胞周期于G₀/G₁期，从而降低细胞增殖率相关。

SCD1不仅调控细胞的脂质合成，而且我们发现抑制SCD1活性可通过阻滞细胞周期对乳腺癌MCF-7细胞产生显著的生长抑制作用。然而，SCD1同时调节脂质代谢和肿瘤细胞增殖的机制尚未阐明。细胞生长和增殖取决于合成代谢和分解代谢相互调节。在哺乳动物细胞中，两个主要的信号蛋白，蛋白激酶B(Akt)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)调控着多个关键的生物合成和分解代谢反应^[11-14]。脂质合成过程也受到Akt和AMPK的调节^{[12, 14]}。Akt是糖源化脂肪酸合成的强大诱导剂，主要调节脂肪酸合成通路中多种酶的转录和活性^[11-12]。此外，Akt信号通路还涉及癌症发生发展^[15-16]。Akt通路的持续激活，与肿瘤形成以及维持恶性表型密切相关^[17]。本研究结果显示，应用SCD1抑制剂干预MCF-7细胞后，pAkt的水平显著下降，pAkt/Akt降低约59%，表明抑制SCD1活性，不仅抑制着脂肪酸合成，而且下调Akt信号通路，导致细胞分裂周期停滞，增殖降低。AMPK，是细胞燃料的传感器，在能量缺乏等应激条件下被激活。与Akt诱导合成代谢信号相反，AMPK磷酸化活化能下调脂质合成通路，并且促进脂质氧化反应^[13]。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的限速酶，ACC是AMPK下游的一个主要作用靶点^[14]。AMPK磷酸化活化，催化ACC磷酸化从而活性降低，抑制了脂肪酸从头合成，促进了脂肪的β氧化^[18]。我们的结果显示，SCD1抑制剂干预MCF-7细胞后，pAMPK水平显著升高约65%，同时磷酸化ACC(pACC)水平增加约74%，表明抑制SCD1活性能诱导AMPK磷酸化，催化ACC磷酸化失活，下调脂肪酸合成。

综上，抑制SCD1活性的抗肿瘤作用机制可能为：一是通过下调pAkt水平抑制Akt通路，从而下调脂肪酸合成，抑制细胞增殖和存活。二是通过诱导AMPK磷酸化活化AMPK通路，催化ACC磷酸化，活性降低，从而下调脂肪酸合成。