人口出生率的下降严重影响我国人口年龄结构及未来劳动力储备，不孕不育夫妇中男性因素所致不育占比约为40%～50%^[1]。少、弱精子症是男性不育最常见的疾病构成因素，约占58%～64%^[2]。尽管现代医学针对少、弱精子症的发病机制进行了大量研究，但目前尚缺乏疗效确切的治疗药物。虽然辅助生殖技术为少、弱精子症的患者带来了生育的希望，但辅助生殖技术的成功率仍较低，如IVF-ET妊娠率仅为4%～40%^[3]。中医药治疗男性不育历史悠久，疗效确切，中药复方根据辨证论治，从整体着手，具有多途径、多靶点的特点^[4]。本课题组通过一项基于4779例大样本人群的Meta分析发现，中医药可有效提升精子数量与精子活力^[5]。

黄精赞育胶囊是王琦院士针对男性不育“肾虚夹湿热瘀毒虫”病机研发的国家中药三类新药，自2005年上市以来，已在全国18个省市1000多家医院临床应用。黄精赞育胶囊从整体调节出发，通过补肾益气、温阳行气、祛瘀行滞治疗少、弱精子症，取得了良好的临床疗效。经实验研究及临床应用表明，黄精赞育胶囊能增加精子数量，提高精子活力，有效治疗少、弱精子症引起的男性不育^[6-9]。

线粒体自噬是一类针对线粒体的靶物特异性自噬，一方面用于清除功能障碍或严重损伤的线粒体，从而实现线粒体质量控制^[10]；一方面在能力匮乏的情况下通过自噬为细胞提供能量来源，作为营养储备的补充^[11]。尽管自噬调控机制复杂，多种信号级联和调控机制均可调节自噬活性，但AMPK可能是生物进化过程中最保守的自噬诱导因子，参与了绝大多数自噬途径^[12]。有学者发现，AMPK同其他线粒体自噬相关蛋白广泛存在于人类精子中，并保持高活性，提示线粒体自噬机制参与了精子功能调节及生存保障^[13]。新近研究发现，能量代谢传感器AMPK可通过调节线粒体发生、线粒体动力学、线粒体自噬等对线粒体的稳态进行整体调控，保证ATP合成与能量供应，是线粒体稳态调节的关键因子^[14]。在前期动物实验中，本课题组发现黄精赞育胶囊可有效恢复少、弱精子症大鼠生精细胞的减数分裂，促进生精细胞增殖，提升精细胞及精子数量。为进一步探究黄精赞育胶囊是否通过影响AMPK介导的线粒体自噬机制达到对少、弱精子症的治疗效果，本研究采用体外细胞实验的方法，探究黄精赞育胶囊治疗少、弱精子症的分子机制。

1.   材料与方法

1.1   细胞及细胞培养

GC-2spd（ts）小鼠精母细胞，购买于中国科学院昆明细胞库。GC-2spd细胞贴壁培养于DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清），在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每2～3 d传代一次。

1.2   主要试剂和仪器

蛋白质常规分子量标记（10～180 kDa）：Proteintech，货号：PL00001；超宽分子量预染蛋白质标记（10～310 kDa）：Proteintech，货号：PL00003；RIPA Lysis Buffer（Medium）：江苏康为世纪，货号：CW2334；Protease Inhibitor Cocktail：江苏康为世纪，货号：CW2200；Phosphatase Inhibitor Cocktail：江苏康为世纪，货号：CW2383；BCA ProteinAssayKit：江苏康为世纪，货号：CW0014；SDS-PAGE LoadingBuffer（Reducing）：江苏康为世纪，货号：CW0027；30%Acrylamide∶BisSolution：江苏康为世纪，货号：CW0024；SDS-PAGE Stacking Gel Buffer：江苏康为世纪，货号：CW0025；SDS-PAGE Separating Gel Buffer：江苏康为世纪，货号：CW0026；过硫酸铵：上海阿拉丁，货号：A112450；PAGE胶促凝剂：北京索莱宝，货号：T8090；Tris-Glycine SDS Buffer：江苏康为世纪，货号：CW0045；Tris-Glycine Transfer Buffer：江苏康为世纪，货号：CW0044；甲醇：Innochem，货号：A84469；TBST：江苏康为世纪，货号：CW0043；siRNA购自吉玛基因，Negative control组序列（5' to 3'）：sense：UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT；antisense：ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT；1115l组序列（5' to 3'）：sense：GCCUCACCCUGAAAGAGUATT； antisense：UACUCUUUCAGGGUGAGGCTT ； Lipo 8000转染试剂，碧云天，货号：C0533FT。抗体：LC3B(ESQ2K)MousemAb：CST.3t5：83506S；SOSTM1/p62Antibody：CST.#9：5114S；AMPKα（D5A2）Rabbit mAb：CST，货号：5831S；Phospho-AMPKα（Thr172）（40H9）Rabbit mAb：CST，货号：2535S；PINK1：santacruz，货号：sc-517353；Parkin：santacruz，货号：sc-32282；TBK1：abcam，货号：ab40676；ULK1、（D8H5）Rabbit mAb：CST，货号：8054S；GAPDH、Monoclonal antibody：Proteintech，#3：60004-1-Ig；GoatAnti-MouseIgG（H+L）-HRPConjugated：北京柏奥易杰，货号：BE0102；GoatAnti-RabbitIgG（H+L）-HRPConjugated：北京柏奥易杰，货号：BE0101；JC-10Mitochondrial膜Potential Assay试剂盒（Microplate）（ab112134）；黄精赞育胶囊（Huang Jing Zan Yu Capsule, HJZY）：国药准字Z20050267，生产厂家：上海新亚药业邗江有限公司，规格：0.31 g 24粒/瓶，主要成分为何首乌（制）、黄精（酒制）、枸杞子、菟丝子、五味子、熟地黄、肉苁蓉、淫羊藿、紫河车、续断、党参、当归、丹参、蒲公英、败酱草、蛇床子、蜂房（炒）、水蛭、牡蛎、车前子（盐炒）。共聚焦荧光显微镜（奥林巴斯，fv3000）。

1.3   丙烯醛诱导少弱精子症细胞模型的构建

有研究发现，丙烯醛（acrolein, ACR）可抑制Akt、mTOR的磷酸化，继而引起过度自噬，与环磷酰胺引起的大鼠少、弱精子症结果相似，因此本研究选择ACR作为少弱精子症细胞模型的造模药^[15]。在通风橱内配制含10、20、30、40、50、60 μmol/L ACR的完全培养基，由于ACR具有强挥发性，实验中现配现用。将GC-2spd细胞种于96孔板，每孔约1×10⁴个细胞，每组3个复孔，摇匀细胞，然后加入上述配制的含ACR完全培养基进行细胞培养。分别于培养5、10、15、20、25、30 min时取出部分细胞进行CCK8细胞活性检测，根据细胞活力确定后续造模用ACR浓度和造模时间。

1.4   黄精赞育胶囊保护作用浓度的选择

在超净台中分别配置用DMSO提取的含0、10、20、40、80、160、320、640 μmol/L黄精赞育胶囊的完全培养基。李博怿等^[16]证明HJZY给药24 h后GC-2spd细胞活力明显升高，因此本实验以24 h为HJZY给药时间。将GC-2spd（ts）以1×10⁴个/孔接种到于96孔板，细胞长到80%左右时，构建少弱精子症细胞模型，造模成功后加入不同浓度上述含黄精赞育胶囊的完全培养基进行细胞培养，于24 h后CCK8细胞活性检测，根据细胞活力确定后续给药浓度。

1.5   CCK-8检测细胞活力

上述实验进行结束后，弃去上清液，加入含有CCK-8的DMEM继续孵育2 h，然后置于酶标仪450 nm处检测OD值，将正常细胞组的细胞活力视为100%，其他组的OD值进行相比，得到细胞存活率。

1.6   共聚焦荧光显微镜检测线粒体膜电位改变

GC-2spd（ts）小鼠精母细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，细胞贴壁后分为NC对照组，造模组，ACR+HJZY给药组，每组3个复孔。造模组加入34 μmol/L ACR造模20 min后弃去含药培养基，PBS清洗两遍后加入完全培养基。ACR+HJZY给药组加入34 μmol/L ACR造模20 min后弃去含药培养基，PBS清洗两遍加入160 μmol/L含黄精赞育胶囊的完全培养基孵育24 h。给药结束后，使用JC-10Mitochondrial膜Potential Assay试剂盒进行线粒体膜电位染色。具体操作如下：向5 mL Assay Buffer A（Component B）中加入50 μL 100×JC-10（Component A），混合均匀。在96孔板中加入50 μL/孔的JC-10上染液。在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中避光孵育1 h。孵育结束后，在上述孔中加入50 μL/孔的Assay Buffer B （Component C）。结束后使用荧光显微镜下观察荧光情况并拍照。

1.7   基因敲减AMPK

将细胞以3×10⁶个/皿的密度接种于六个6 cm培养皿中，分为siRNA-NC+control、siRNA-NC+ACR、siRNA-NC+ACR+HJZY、siRNA-AMPK+control、siRNA-AMPK+ACR、siRNA-AMPK+ACR+HJZY六组，细胞长到60%左右时，进行siRNA-NC或siRNA-AMPK转染。根据分组每组细胞分别配制含100 pmol的siRNA-NC或siRNA-AMPK转染体系，加入4 μL的Lipo8000转染试剂，轻轻混匀，室温静置20 min。用移液枪吸取125 μL转染混合物加入细胞中并轻轻晃动混匀，然后放入培养箱继续培养6 h后, 弃去含转染试剂的培养基, 更换新鲜培养基。转染48 h后检测蛋白的表达情况。

1.8   Western blot

细胞实验结束后，弃去培养基，用冰冷PBS洗涤细胞2次。RIPA裂解液分别提取各组细胞蛋白，后采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。采用10%的SDS-PAGE凝胶，20 μg上样量，进行电泳，80 V恒压至样品进入分离胶后改120 V恒压至电泳结束。后采用350 mA恒流60 min进行电转。电转结束后，PVDF膜用5%脱脂奶粉常温封闭90 min。封闭结束后，用TBST把PVDF膜上的牛奶洗干净。一抗孵育PVDF膜并4 ℃摇床封闭过夜，孵育结束回收一抗。第二天TBST洗膜3次后，选择合适的二抗，室温孵育1 h后，TBST洗3次，加入ECL化学发光试剂，曝光，显影。用ImageJ软件进行灰度值分析，以目的蛋白和GAPDH条带灰度值的比值代表各个目的蛋白表达的相对水平。

1.9   统计学方法

实验结果运用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据用$\bar x\pm s $表示。当各组数据分别服从正态分布，且方差齐性时，使用单因素方差分析，看LSD的检验结果；若各组数据分别服从正态分布，但方差不齐时，看Dunnett'sT3的检验结果。若各组数据不服从正态分布，则使用非参数检验法进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   细胞造模给药条件

分别以不同浓度的ACR（10、20、30、40、50、60 μmol/L）孵育细胞30 min，细胞存活率随ACR浓度的增加而呈现下降趋势（图1）。结果显示，15 min、20 min、25 min与30 min细胞抑制率曲线基本重合，提示该造模时间范围细胞活性稳定，后续以20 min作为造模时间。

图  1  ACR造模细胞存活率（n=3）

Figure  1.  Survival rate of the ACR modeling cells (n = 3)

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取造模20 min后更换完全培养基培养细胞24 h后各浓度细胞，CCK8检测OD值，计算细胞抑制率。发现含10～20 μmol/L浓度的ACR完全培养基对细胞抑制作用不明显，30、40、50、60 μmol/L浓度的ACR完全培养基对GC-2spd细胞有明显抑制作用（P<0.001）（图2）。通过SPSS 20.0计算IC₅₀为33.99，因此后续实验以34 μmol/L作为造模浓度。

图  2  ACR造模后20 min 细胞的抑制率

^** P < 0.01, ^*** P < 0.001, vs. 0 μmlo/L. n = 3.

Figure  2.  Cell inhibition rate at 20 minutes of ACR modeling time

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根据上述实验获得的干预条件进行造模给药，即34 μmol/L ACR造模20 min之后分别以10、20、40、80、160、320、640 μmol/L HJZY给药24 h。结果（图3）显示，给药24 h后，ACR 组细胞活力低于NC组，差异有统计学意义（P<0.001）。40、80、160 μmol/L HJZY组的细胞活力相较于 ACR 组均有差异，其中160 μmol/L HJZY组与ACR组相比活力提升最明显（P<0.001），后续实验以含160 μmol/L为HJZY给药浓度。

图  3  ACR造模后不同浓度HJZY给药24 h细胞活力

^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001, vs. NC group. n = 3.

Figure  3.  Cell viability of the ACR cells treated with different concentrations of HJZY for 24 hours

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2.2   共聚焦荧光显微镜检测结果

根据JC-10染色结果（图4）可见，NC组红绿光比值为1.69±0.0411，造模组红绿光比值为0.184±0.0242，ACR+HJZY组红绿光比值为0.350±0.0310，造模组线粒体膜电位较NC组大幅降低（P<0.05），HJZY给药后ACR+HJZY组细胞膜电位较造模组有所升高（P<0.05），但仍低于NC组（P<0.05）。

图  4  JC-10染色后共聚焦荧光显微镜检测荧光表达情况（×400）

Figure  4.  Fluorescence expression by confocal fluorescence microscopy after JC-10 staining (original magnification × 400)

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2.3   黄精赞育胶囊对AMPK介导的线粒体自噬相关蛋白的调控作用

Western blot结果（图5、图6）显示siRNA-NC+ACR组p-AMPK/AMPK蛋白表达水平较siRNA-NC+control组下降（P<0.001），siRNA-NC+ACR+HJZY给药后水平上升（P<0.001）。基因敲减后siRNA-AMPK+ACR与siRNA-AMPK+control组相比蛋白表达水平下降（P<0.05），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组较siRNA-AMPK+ACR组差异无统计学意义。siRNA-AMPK+control组与siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平下降（P<0.001），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比蛋白表达水平下降（P<0.05），siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组差异无统计学意义。

图  5  各蛋白表达

Figure  5.  Expression of various indicator proteins

1: siRNA-NC + control group; 2: siRNA-NC + ACR group; 3: siRNA-NC + ACR + HJZY group; 4: siRNA-AMPK + control group; 5: siRNA-AMPK + ACR group; 6: siRNA-AMPK + ACR + HJZY group.

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图  6  p-AMPK/AMPK、p62、LC3B、PINK1、Parkin、ULK1和TBK1蛋白表达水平

Figure  6.  Expression levels of p-AMPK/AMPK, p62, LC3B, PINK1, Parkin, ULK1, and TBK1 proteins

^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001. n = 3.

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LC3B蛋白表达水平siRNA-NC+ACR组较siRNA-NC+control组上升（P<0.01），siRNA-NC+ACR+HJZY组较siRNA-NC+ACR组有所下降（P<0.05）。基因敲减后siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-AMPK+control组相比蛋白表达水平有所升高但差异无统计学意义，siRNA-AMPK+ACR+HJZY组较siRNA-AMPK+ACR蛋白表达水平下降（P<0.01）；siRNA-AMPK+control与siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平下降但差异无统计学意义，siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比蛋白表达水平下降（P<0.01），siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组相比蛋白表达水平下降（P<0.01）。

P62蛋白表达水平siRNA-NC+ACR组较siRNA-NC+control组上升（P<0.001），siRNA-NC+ACR+HJZY组较siRNA-NC+ACR组有所下降（P<0.001）。基因敲减后siRNA-AMPK三组蛋白间差异无统计学意义；siRNA-AMPK+control组与siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平上升（P<0.001），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比蛋白表达水平上升（P<0.001），siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组相比蛋白表达水平上升（P<0.001）。

PINK1蛋白表达水平siRNA-NC+ACR组较siRNA-NC+control组下降（P<0.001），siRNA-NC+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR组比较水平上升（P<0.01）。基因敲减后siRNA-AMPK+ACR与siRNA-AMPK+control组相比蛋白表达水平下降（P<0.05），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组较siRNA-AMPK+ACR组有所上升但差异无统计学意义；siRNA-AMPK+control与siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平下降（P<0.05），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比蛋白表达水平下降（P<0.05），siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组间的差异无统计学意义。

Parkin蛋白表达水平siRNA-NC+ACR组较siRNA-NC+control组有所下降，但差异无统计学意义，siRNA-NC+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR组比较水平上升（P<0.01）。基因敲减后siRNA-AMPK+ACR与siRNA-AMPK+control组相比蛋白表达水平下降（P<0.01），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-AMPK+ACR组相比差异无统计学意义；siRNA-AMPK+control组与siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平升高，siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR相比略微降低，但差异均无统计学意义，siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比蛋白表达水平下降（P<0.05）。

TBK1蛋白表达水平siRNA-NC+ACR组较siRNA-NC+control组上升（P<0.05），siRNA-NC+ACR+HJZY组较siRNA-NC+ACR组大幅下降（P<0.001）。基因敲减后siRNA-AMPK+control组与siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平大幅下降（P<0.001），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比差异无统计学意义，siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组相比蛋白表达水平下降（P<0.001）。

ULK1蛋白表达水平siRNA-NC+ACR组较siRNA-NC+control组上升（P<0.01），siRNA-NC+ACR+HJZY组较siRNA-NC+ACR组大幅下降（P<0.001）。基因敲减后siRNA-AMPK+control和siRNA-NC+control组相比蛋白表达水平大幅下降（P<0.001），siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组相比蛋白表达水平下降（P<0.05），siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-NC+ACR+HJZY组相比差异无统计学意义。

3.   讨论

线粒体是细胞内能量转换和控制细胞凋亡的重要细胞器，研究表明不育男性精子运动能力的下降的同时可检测到精子线粒体膜电位下降^[17]。本研究中，通过JC-10线粒体膜电位检测结果发现ACR造模后的GC-2spd（ts）小鼠精母细胞中线粒体膜电位大幅下降，而黄精赞育胶囊组对比模型组线粒体膜电位有所上升，提示黄精赞育胶囊治疗少、弱精子症的分子机制可能是通过调节线粒体膜电位发挥作用。

p-AMPK是指磷酸化的AMPK，AMPK的激活主要是通过磷酸化来实现的，故可通过p-AMPK/AMPK的比值反映AMPK的激活程度^[18]。蛋白免疫印迹实验发现siRNA-NC组中与对照组相比，ACR组p-AMPK/AMPK比值明显下降（P<0.001），AMPK激活受抑制；与ACR组相比，HJZY组有效提高了p-AMPK/AMPK的蛋白的表达水平（P<0.001），推测黄精赞育胶囊可通过促进AMPK磷酸化调控线粒体自噬，从而达到治疗少弱精子症的目的。siRNA-AMPK三组p-AMPK/AMPK值相较siRNA-NC组均明显降低，ACR组较对照组比值下降（P<0.01），AMPK敲减成功。

LC3BⅡ 是自噬体的标志性蛋白，其含量的变化一定程度上可以反映自噬体的数量变化^[19]。在细胞自噬过程中，当自噬被激活时，会有更多的LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ，导致LC3BⅡ的水平升高。siRNA-NC组结果显示，与对照组相比，ACR组的LC3BⅡ蛋白水平升高（P<0.01），细胞内自噬水平异常增加；与ACR组比较，ACR+HJZY组的LC3BⅡ蛋白水平有所下降（P<0.05），HJZY的干预使细胞内自噬水平降低到正常范围。siRNA-AMPK三组较siRNA-NC三组LC3BⅡ蛋白水平降低，提示AMPK敲减后细胞内整体自噬水平降低。

P62是一种多功能的泛素-蛋白酶体系统和自噬途径的衔接蛋白，在细胞内的蛋白质降解和自噬过程中发挥关键作用^[20]。通过检测P62的水平变化，结合LC3BⅡ等其他指标，可以更全面地了解自噬过程的状态，评估药物对自噬的影响。本实验中siRNA-NC组中较对照组，ACR组P62水平升高（P<0.001），可能是ACR造模后细胞自噬体形成受阻导致P62蛋白在细胞内积累。相比于ACR组，HJZY组降低P62蛋白的表达（P<0.001）至与对照组相近，改善了细胞内P62异常增多的情况。siRNA-AMPK三组P62蛋白表达均明显升高，分析原因可能是因为AMPK敲减可能使细胞处于一种能量应激或代谢紊乱的状态，在应激条件下细胞可能通过增加P62的表达来增强其对受损蛋白质和细胞器的清除能力。

为进一步证明黄精赞育胶囊对线粒体自噬机制的调控作用，选择线粒体自噬经典通路PINK1/Parkin上的关键蛋白进行Western blot检测，目的是观察黄精赞育胶囊对线粒体自噬关键蛋白表达水平的影响。siRNA-NC组结果显示，与对照组比较，ACR组的PINK1蛋白表达水平降低（P<0.001）；与ACR组相比，ACR+HJZY组的PINK1蛋白水平有升高的趋势（P<0.01）；siRNA-AMPK三组较siRNA-NC三组整体蛋白表达水平下降但趋势相同，与对照组比较，ACR组的PINK1蛋白表达水平降低（P<0.05）。Parkin蛋白水平方面，siRNA-NC组中与ACR组相比，ACR+HJZY组的水平有升高的趋势（P<0.001），siRNA-AMPK组中ACR组较对照组蛋白表达趋势与siRNA-NC组相同，有所降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

AMPK/ULK1/TBK1通路是由AMPK介导的经典自噬通路，TBK1是线粒体自噬过程中十分重要的一个蛋白，它能通过与PINK1相互作用促进Parkin的定位和激活，从而促进线粒体自噬过程的进行^[14]。但一些研究表明，在氧化损伤条件下TBK1的会抑制线粒体自噬的启动和执行，从而阻碍Parkin介导的线粒体自噬^[21]。在本实验中，siRNA-NC组黄精赞育胶囊能够大幅下调ACR引起的TBK1异常升高（P<0.001），说明其对线粒体自噬的启动和执行具有正向调节作用。siRNA-AMPK三组蛋白表达较siRNA-NC组降低，但组间差异无统计学意义，可能是因为AMPK和TBK1在细胞内的功能有一定的交叉和相互作用，在细胞能量应激状态下，AMPK的激活可能会影响TBK1对免疫信号的传导。通过对ULK1 siRNA-NC三组蛋白的免疫印迹发现，HJZY组可降低ACR组ULK1过激表达引起的细胞自噬（P<0.001）。而siRNA-AMPK组中ACR+HJZY组较ACR组蛋白表达水平无明显变化。

SALIMI等^[22]发现，环磷酰胺会导致溶酶体膜损伤，干扰自噬体与溶酶体的融合，从而导致自噬体无法正常降解。在本实验中，鉴于ACR是环磷酰胺的体内代谢产物，其对PINK1和Parkin表达水平呈现出抑制作用，同时过度激活了TBK1。由此推测，ACR或许干扰了线粒体自噬流进程，致使细胞难以将包裹线粒体的自噬小体及时清除，从而造成LC3BⅡ无法被充分降解，最终导致LC3BⅡ蛋白表达水平上升，使得整个线粒体自噬环节出现功能障碍。这种功能障碍可能和ACR对溶酶体功能的损害存在关联。而黄精赞育胶囊能够推动AMPK活化，提升PINK1与Parkin的表达量，并降低过度激活的TBK1水平，以此有效修复ACR引发的线粒体自噬流受阻状况，让LC3BⅡ得以正常降解，使其蛋白水平回归正常。据推测，其作用原理可能是借助激活AMPK的磷酸化进程，恢复线粒体自噬功能异常，清除受损线粒体的堆积，重新开启并推动线粒体自噬流程。

综上所述，黄精赞育胶囊治疗少弱精子症的机制可以从AMPK及细胞自噬层面得到一定验证，并且还有很大继续深入研究的空间。希望通过之后的实验继续为传统中医药理论赋予现代化、科学化的阐释。

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作者贡献声明　高源负责论文构思、正式分析、调查研究和审读与编辑写作，郭怡阳负责验证，武默涵负责初稿写作，郑燕飞负责经费获取、研究方法、研究项目管理、提供资源和监督指导。所有作者已经同意将文章提交给本刊，且对将要发表的版本进行最终定稿，并同意对工作的所有方面负责。

Author Contribution　 GAO Yuan is responsible for conceptualization, formal analysis, investigation, and writing--review and editing. GUO Yiyang is responsible for validation. WU Mohan is responsible for writing--original draft. ZHENG Yanfei is responsible for funding acquisition, methodology, project administration, resources, and supervision. All authors consented to the submission of the article to the Journal. All authors approved the final version to be published and agreed to take responsibility for all aspects of the work.

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

Declaration of Conflicting Interests　All authors declare no competing interests.