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frtR Gene Affects Acid Production and Demineralization Ability of Streptococcus mutans
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摘要:目的 研究TetR家族frtR基因对变异链球菌产酸能力和诱导牙体脱矿能力的影响。方法 检测frtR基因框内缺失株（ΔfrtR）及回复株（ΔfrtR/pDL278-frtR）的生长情况；通过共聚焦激光扫描显微镜观察菌株的生物膜结构，并用蒽酮-硫酸法定量检测生物膜中的水不溶性胞外多糖（extracellular polysaccharide, EPS）；通过糖酵解pH drop实验检测菌株的产酸能力；通过横断显微放射技术（transverse micro radiography, TMR）检测菌株诱导牛牙脱矿的能力。结果 菌株生长曲线结果表明frtR基因对变异链球菌的生长无明显影响；共聚焦激光扫描显微镜观察结果显示frtR基因对变异链球菌生物膜形成无明显影响，硫酸-蒽酮法检测发现frtR基因对变异链球菌EPS合成亦无明显影响；糖酵解pH drop实验结果表明，当蔗糖为唯一碳源时，敲除frtR基因延缓了变异链球菌的产酸速率；TMR实验结果表明，敲除frtR基因降低了变异链球菌在牛牙表面诱导形成的脱矿深度和脱矿量。结论 frtR基因缺失会减弱变异链球菌的产酸能力及诱导牙体组织脱矿能力。Abstract:Objective To study the effect of the frtR gene of TetR family on the acid production ability of Streptococcus mutans (S. mutans) and the bacteria's ability to induce tooth demineralization.Methods The growth of two strains of S. mutans UA159, ΔfrtR, the frtR gene in-frame deletion strain, and ΔfrtR/pDL278-frtR, the complement strain, was examined. The structure of biofilm was observed by laser scanning confocal microscopy (LSCM). The quantitative determination of water-insoluble extracellular polysaccharide (EPS) in the bacterial biofilms was done by anthrone-sulfuric acid method. The acid production capacity of S. mutans was measured by glycolytic pH drop. The demineralization-inducing ability of the strains on bovine teeth was determined by transverse microradiography (TMR).Results The growth curves of the strains showed that frtR did not affect the growth of S. mutans. According to the findings of LSCM observation, frtR did not affect the biofilm formation. According to the findings of the anthrone-sulfuric acid method, frtR did not have any significant impact on the EPS synthesis of S. mutans. The results of the glycolytic pH drop assay showed that the deletion of frtR delayed the rate of acid production by S. mutans when sucrose was the only carbon source. In addition, according to the TMR results, knocking out frtR reduced the depth and amount of demineralization induced by S. mutans on the surface of bovine teeth.Conclusion The deletion of frtR can weaken the acid production ability and the demineralization ability of S. mutans.
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龋病是一种多因素复合导致的牙齿硬组织进行性病损，表现为无机物的脱矿及有机物的分解[1]。变异链球菌是最早发现也是目前研究最多的口腔致龋菌之一，亦是致龋性生物膜中的重要定植菌之一[2-4]。变异链球菌的主要致龋毒力包括产酸、耐酸和合成胞外多糖（extracellular polysaccharide, EPS）等。变异链球菌可以通过磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统（the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system, PEP-PTS）和结合蛋白运输系统（binding-protein transport system, BPTS）转运环境中的糖类物质并将其磷酸化，再通过糖酵解途径将磷酸化的糖发酵为丙酮酸，丙酮酸又可以通过一系列支链途径形成乳酸、甲酸、乙酸等酸性物质[5-8]。变异链球菌产生的酸性物质可以有效降低牙菌斑微环境的pH值，形成局部酸性位点，促进牙体组织脱矿[9]。
TetR家族转录因子在细菌中普遍存在，参与新陈代谢、抗生素合成、群体感应、生物膜形成和耐药性等多种生命活动[10-14]。变异链球菌UA159编码至少18个TetR家族转录因子，其中frtR基因已被证实通过调控frtP基因表达量影响变异链球菌对氟化物的敏感性[7, 15]。然而frtR基因是否参与调控变异链球菌的产EPS能力、产酸及脱矿能力等致龋毒力尚未可知。本研究围绕致龋毒力对变异链球菌UA159、frtR基因缺失株（ΔfrtR）和回复株（ΔfrtR/pDL278-frtR）的产酸能力、EPS合成能力和诱导牙体组织脱矿能力进行了系统的检测。
1. 材料和方法
1.1 细菌菌株及生长条件
本研究中使用的变异链球菌UA159来自于口腔疾病研究国家重点实验室口腔微生物资源库，ΔfrtR和ΔfrtR/pDL278-frtR来自课题组前期制备[15]。变异链球菌UA159及其突变株使用牛脑心浸出液（BHI, BD）作为培养基，在37 ℃，体积分数分别为90% N2、5% CO2、5% H2环境下培养。培养变异链球菌生物膜时则在BHI培养基中添加1%蔗糖（命名为BHIS培养基）。过夜培养回复株时，在BHI培养基中添加1000 μg/mL壮观霉素。
1.2 生长曲线
将过夜培养的变异链球菌菌株1∶10稀释至BHI培养基中，继续培养至指数生长期〔600 nm下的光密度值（OD600）=0.5 〕，再用新的BHI培养基将其1∶100稀释。将稀释后的菌液加入无菌96孔板（Corning, NY）中（200 μL/孔），并在菌液上覆盖无菌矿物油，利用无菌BHI作为空白对照。使用Multiskan Spectrum （Thermo, Multiskan Go, USA）每半小时测量OD600，每个样本均有至少3个重复。
1.3 水不溶性EPS定量检测
将过夜培养的变异链球菌菌株1∶10稀释至BHI培养基中，继续培养至指数生长期（OD600=0.5），再用新的BHIS培养基将其1∶100稀释。将稀释后的细菌立即转移到无菌24孔板（Corning, NY）（1 mL/孔）中，在37 ℃，体积分数分别为90% N2、5% CO2、5% H2中孵育24 h。孵育后，轻轻倒出培养基，用无菌PBS轻柔洗涤生物膜3次，以去除浮游细胞和贴壁疏松的细胞。最后用1 mL无菌PBS重悬生物膜后，离心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）。丢弃上清液后，重新悬浮细胞颗粒，用无菌PBS洗涤3次，以去除水溶性细胞外多糖。从这些样品中提取的水不溶性EPS在37 ℃下用1 mol/L NaOH振荡溶解2 h。将离心得到的上清液与3倍体积的蒽酮-硫酸试剂混合，在95 ℃水浴中加热6 min，冷却至室温后，测定样本在625 nm处的OD值并记录。每组实验重复3次。
1.4 共聚焦显微镜观察生物膜
将过夜培养的变异链球菌菌株1∶10稀释至BHI培养基中，继续培养至指数生长期（OD600=0.5），再用新的BHIS培养基将其1∶100稀释。将稀释后的细菌立即转入含有无菌玻璃圆片的24孔板（Corning, NY）（1 mL/孔）中，在菌液中加入1 μmol/L的Alexa Fluor 647葡聚糖偶联物（Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）以标记葡聚糖，37 ℃，体积分数分别为90% N2、5% CO2、5% H2中孵育24 h后，用双蒸水清洗盖玻片2次，以去除浮游和松散结合的细胞。随后，用2.5 μmol/L SYTO 9 （Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）染色15 min。采用尼康共聚焦激光扫描显微镜（CLSM; Nikon, N-SIM），60×油浸物镜观察生物膜。SYTO 9的激光波长设置为495～515 nm，Alexa Fluor 647的激光波长设置为655～690 nm，每个生物膜随机选择5个位置进行扫描。除此之外，利用COMSTAT和Image J软件分析上述生物膜中的菌体含量及EPS含量，每组样本至少含3次重复。
1.5 细菌产酸能力检测
本研究通过糖酵解pH drop实验检测细菌的产酸能力[16]。首先将过夜培养的变异链球菌菌株1∶10稀释至BHI培养基中，继续培养至指数生长期（OD600=0.5）。取等体积菌液离心（4 000 r/min, 10 min, 4 ℃），去除上清，用等体积pH=6.5的0.5 mmol/L磷酸钾缓冲液（含37.5 mmol/L KCl和1.25 mmol/L MgCl2）重悬菌体沉淀，离心后用等体积含不同糖（10 g/L蔗糖、10 g/L果糖、10 g/L葡萄糖）的上述磷酸钾缓冲液重悬，间隔相同时间检测并记录溶液pH值。每组实验重复3次，计算平均值。
1.6 细菌脱矿能力检测
利用横断显微放射技术（transverse microradiography, TMR）检测菌株诱导牙体组织脱矿的能力[17]。首先选择肉眼观察表面光滑、平整一致且无裂痕无着色无缺损的牛牙（汶川百瑞农业，中国），将其冠根切开。牙冠制备为直径1 cm、高0.5 cm的类圆柱体，利用AB胶包埋样本。后续使用砂纸在牙釉质面开窗，周围利用指甲油封闭，检测显微硬度以淘汰已脱矿的样本。剩余的样本经高压蒸汽灭菌处理后，在含有变异链球菌菌株（OD600=0.5）的BHIS培养基中培养24 h，后续每天更换新鲜的BHIS培养基，持续5 d。将处理后的样本切割并打磨抛光至厚度为100～150 nm，再利用横断面显微成像系统（SOFTEX）通过与标准“铝阶”对比，利用软件（TMR 2012, Inspektor Research BV, Amsterdam, The Netherlands）计算样本脱矿深度及脱矿量。
1.7 统计学方法
以上实验均重复3次，每次重复实验均设置3组平行对照。组间差异使用单因素方差分析（ANOVA）进行比较，两两差异用Student’s t test进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 frtR缺失对变异链球菌生长的影响
如图1所示，ΔfrtR的生长曲线相较于UA159和ΔfrtR/pDL278-frtR，没有明显差异。这说明frtR缺失不影响变异链球菌的生长。
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图 1 变异链球菌生长曲线（n=3）Figure 1. The growth curves of Streptococcus mutans (S. mutans) (n=3)2.2 frtR缺失对变异链球菌水不溶性EPS合成的影响
通过硫酸-蒽酮法定量检测水不溶性EPS，发现变异链球菌UA159、ΔfrtR、ΔfrtR/pDL278-frtR之间水不溶性EPS合成量无明显差异（图2A）。分别用不同的荧光染料对生物膜中的变异链球菌和水不溶性EPS进行染色，在共聚焦激光扫描显微镜下观察发现，变异链球菌UA159、ΔfrtR、ΔfrtR/pDL278-frtR之间细菌生物量和水不溶性EPS含量均无明显改变（图2B、图2C）。说明敲除frtR不影响变异链球菌水不溶性EPS合成。
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图 2 变异链球菌水不溶性EPS含量及生物膜形成Figure 2. The water-insoluble EPS content and biofilm formation of S. mutans strainsA: Water-insoluble EPS content of biofilms quantified using the anthrone-sulfuric method (a: S. mutans UA159, b: S. mutans ΔfrtR, c: ΔfrtR/pDL278-frtR, n=3); B: The biofilm dual-labeled images of EPS (red, Alexa Flour 647) and bacteria (green, SYTO 9), which were captured using a 60× oil immersion objective; C: The quantitative analysis of biofilms performed using COMSTAT and Image J (n=3).2.3 frtR缺失对变异链球菌产酸的影响
如图3A所示，在蔗糖作为唯一碳源时，ΔfrtR的菌液pH值在7～19 min时间段与UA159及ΔfrtR/pDL278-frtR的差异有统计学意义（P<0.05）。当果糖或葡萄糖作为唯一碳源时，ΔfrtR的菌液pH值与UA159和ΔfrtR/pDL278-frtR之间无明显差异（图3B，图3C）。以上结果说明，蔗糖作为唯一碳源时，敲除frtR会延缓变异链球菌的产酸速率。
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图 3 变异链球菌在不同生长环境下的产酸能力Figure 3. Acid production of S. mutans under different growing conditionsGlycolytic pH drop of S. mutans solution with 1% sucrose (A), 1% fructose (B) and 1% glucose (C). n=3, *P<0.05, vs. UA159 and ΔfrtR/pDL278-frtR.2.4 frtR缺失对变异链球菌诱导牙体组织脱矿能力的影响
经变异链球菌UA159、ΔfrtR和ΔfrtR/pDL278-frtR处理后的牙体组织都表现出明显的脱矿（图4A）。相比于UA159和ΔfrtR/pDL278-frtR，ΔfrtR在牛牙牙体组织表面诱导形成的脱矿深度和脱矿量均降低（P<0.05，图4B、4C）。说明敲除frtR会减弱变异链球菌诱导牙体组织脱矿能力。
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图 4 变异链球菌菌株诱导牙釉质脱矿的检测结果Figure 4. Measuring enamel demineralization induced by S. mutansA: The cross-section of demineralized enamel by transverse microradiography (TMR); B: The mineral loss of enamel; C: The depth of enamel lesion. n=5, ****P<0.01.3. 讨论
本研究发现frtR基因缺失会导致变异链球菌在蔗糖环境中产酸能力下降以及诱导牙体组织脱矿能力显著降低，说明frtR基因除了参与调控变异链球菌的氟化钠敏感性[15]，还参与调控变异链球菌的产酸能力和诱导牙体组织脱矿能力。
在龋病的发生发展过程中，细菌会代谢环境中的碳水化合物产生酸性物质，环境的酸化是打破牙釉质脱矿与再矿化平衡，诱导牙体组织脱矿能力的重要原因之一[18-19]。变异链球菌的产酸途径受到多种因素调控，转录因子在其中起着重要的作用。研究发现，转录因子Rex可以通过调控变异链球菌中乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）的表达影响丙酮酸转化乳酸途径[20-21]。CcpA和CodY直接调控变异链球菌中磷酸转乙酰酶（phosphotransacetylase, Pta）和乙酸激酶（acetokinase, Ack）的转录，从而影响丙酮酸转化乙酸途径[22]。在本研究中，敲除frtR会导致变异链球菌产酸能力减弱，但根据前期研究中ΔfrtR的转录组分析，敲除frtR对变异链球菌ldh、pta、ack的转录表达均没有显著影响[15]，这说明frtR可能不是通过调控丙酮酸转化为乳酸和乙酸途径关键酶的转录起作用。
TetR家族转录因子已被证明与多种细菌的毒力表型相关[23-25]。除此之外，研究发现TetR家族转录因子参与调控脂肪酸、甘油、烟酸、苯乙酸和间苯二酚等不同碳分解代谢途径[25-28]。在前期研究中，我们发现与变异链球菌UA159相比，ΔfrtR中有16个差异表达基因与碳水化合物的转运和代谢相关，其中13个下调，3个上调[15]。经过GO富集分析发现，这16个差异表达基因又多与PEP-PTS相关，例如smu.115（果糖特异性酶ⅡA）、smu.114（果糖特异性酶ⅡBC）、smu.1961c（N-乙酰半乳糖胺特异性酶ⅡA）、smu.1598（纤维二糖特异性酶ⅡA）、smu.1600（纤维二糖特异性酶ⅡB）、smu.1596（纤维二糖特异性酶ⅡC）、lacF（乳糖特异性酶ⅡA）和lacE（乳糖特异性酶ⅡBC）在ΔfrtR中显著下调，而smu.100～smu.103（甘露糖特异性酶ⅡABCD）显著上调[15]。这提示frtR可能参与调控变异链球菌碳水化合物转运及代谢途径。
综上所述，本研究发现TetR家族基因frtR与变异链球菌产酸能力和诱导牙体组织脱矿的能力密切相关，进一步说明frtR是一个潜在的抗龋作用靶点。在后续的研究中，本课题组将会就碳水化合物的转运与代谢和变异链球菌产酸及诱导牙体组织脱矿能力之间的分子机制进行探究，并且进一步研究frtR调控碳水化合物的转运与代谢的具体作用机制。
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利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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图 1 变异链球菌生长曲线（n=3）
Figure 1. The growth curves of Streptococcus mutans (S. mutans) (n=3)
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图 2 变异链球菌水不溶性EPS含量及生物膜形成
Figure 2. The water-insoluble EPS content and biofilm formation of S. mutans strains
A: Water-insoluble EPS content of biofilms quantified using the anthrone-sulfuric method (a: S. mutans UA159, b: S. mutans ΔfrtR, c: ΔfrtR/pDL278-frtR, n=3); B: The biofilm dual-labeled images of EPS (red, Alexa Flour 647) and bacteria (green, SYTO 9), which were captured using a 60× oil immersion objective; C: The quantitative analysis of biofilms performed using COMSTAT and Image J (n=3).
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图 3 变异链球菌在不同生长环境下的产酸能力
Figure 3. Acid production of S. mutans under different growing conditions
Glycolytic pH drop of S. mutans solution with 1% sucrose (A), 1% fructose (B) and 1% glucose (C). n=3, *P<0.05, vs. UA159 and ΔfrtR/pDL278-frtR.
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