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Establishment of 14-Color Panel for Determining Leukocyte Subsets in Human Peripheral Blood with Flow Cytometry
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摘要:目的 建立14色流式检测人外周血中白细胞亚群方案。方法 用细胞膜表面抗体CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD16、CD14、CD25、CD127、HLA-DR、CD123、 CD11c和核酸染料DAPI建立14色流式染色方案，检测人外周血白细胞主要细胞亚群。取健康成年志愿者外周血标本分别对各抗体进行抗体滴度实验、光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）电压优化、单色染色和减一色染色，确定检测方法和检测条件后，对18例健康成年志愿者外周血标本进行检测分析。结果 根据细胞分群情况和染色指数选择抗体最适质量浓度：CD25和CD127为8.0 μg/mL；CD45、CD3、CD14和CD123为4.0 μg/mL；CD8、CD19、CD56、CD16、HLA-DR和CD11c为2.0 μg/mL；CD4为1.0 μg/mL；DAPI使用质量浓度为0.1 μg/mL。CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD16、CD14、CD25、CD127、HLA-DR、CD123、CD11c和DAPI检测电压分别为：450 V、410 V、400 V、550 V、405V、500 V、520 V、550 V、550 V、400 V、450 V、400 V、580 V和300 V。单色染色和减一色试验确定合适的荧光补偿。采用建立的14色流式检测人外周血白细胞主要亚群的方案检测了18例健康成年人外周血样本，可分析出外周血中各细胞亚群在白细胞中的百分比，以及主要细胞群的免疫表型。结论 成功建立14色流式检测人外周血白细胞亚群方案，结果稳定可靠，操作简便。Abstract:Objective To establish a 14-color flow cytometry protocol for the examination of leukocyte subsets in human peripheral blood.Methods We used cell membrane surface antibodies CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD16, CD14, CD25, CD127, HLA-DR, CD123, CD11c and nucleus staining dye DAPI to establish a 14-color flow cytometry assay to determine the major cell subsets in human peripheral blood. We collected peripheral blood specimens from healthy volunteers to test for antibody titers and optimal photomultiplier tube (PMT) voltage, and to conduct single-color staining and fluorescence minus one control staining. After determining the test method and test conditions, the peripheral blood samples of 18 healthy volunteers were analyzed.Results According to the cell classification and staining index, optimal antibody mass concentrations selected were as follows: CD25 and CD127 at 8.0 μg/mL, CD45, CD3, CD14 and CD123 at 4.0 μg/mL, CD8, CD19, CD56, CD16, HLA-DR and CD11c at 2.0 μg/mL, CD4 at 1.0 μg/mL and DAPI at 0.1 μg/mL. The detection voltages for CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD16, CD14, CD25, CD127, HLA-DR, CD123, CD11c and DAPI were 450 V, 410 V, 400 V, 550 V, 405 V, 500 V, 520 V, 550 V, 550 V, 400 V, 450 V, 400 V, 580 V, and 300 V, respectively. The appropriate fluorescence compensation was determined by single-color staining and fluorescence minus one controls. The 14-color flow cytometry panel was established to analyze the main subsets of leukocytes in human peripheral blood, and peripheral blood samples from 18 healthy adults were examined, obtaining the percentages of each subset of peripheral blood leukocytes and the immunophenotypes of the main subsets.Conclusion We established a 14-color panel for determining leukocyte subsets in human peripheral blood by flow cytometry, which produced stable and reliable results and was easy to operate.
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人外周血中主要成分有红细胞、血小板、白细胞和血浆等。白细胞由多种细胞亚群组成，主要包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等，而淋巴细胞中又包含多个细胞亚群，如T细胞、B细胞和自然杀伤（natural killer, NK）细胞等。血液中白细胞细胞亚群的变化与疾病发生、疾病进展及转归相关，可以通过对这些细胞亚群含量的检测来监测疾病的进展、预后等[1-2]。流式细胞术利用免疫细胞表型，能快速检测各类免疫细胞的含量和功能，提供患者的免疫状态信息，为临床诊断与治疗提供依据。比如T细胞CD4、CD8及CD4/CD8比值的检测，调节T细胞、NK细胞、树突状细胞（dendritic cell, DC）亚群检测等对恶性肿瘤、病毒感染、免疫缺陷、创伤、自身免疫性疾病、器官移植等都具有临床诊断、疾病判断和治疗指导价值[3-5]。但是现有的流式方案大多是将各个细胞亚群分为不同实验来检测，需要多管联合才能完成各细胞亚群分析，难以保证检测的稳定性及精确度，无法获得各细胞亚群之间和细胞表型的相互关系[6]。本实验建立了在单个试管中使用13种荧光抗体和1种荧光素检测健康人群外周血白细胞主要亚群的流式分析方案，实现单管实验分析人血液中免疫细胞。现报道如下。
1. 材料与方法
1.1 材料
荧光素单克隆抗体CD45、CD127购自Biolegend公司；CD3、CD8、CD19、CD56、CD16、CD14、CD25、HLA-DR、CD123、 CD11c、BV stain buffer均购自美国BD Pharmingen公司；CD4购自Thermo Fisher公司；DAPI购自Sigma-Aldrich公司，工作质量浓度为0.1 μg/mL。配置355 nm、405 nm、488 nm、561 nm、633 nm激光器的FACSAria SORP流式细胞仪（美国BD Bioscience）。
1.2 方法
1.2.1 抗体荧光素选择
根据多色流式中抗原与荧光素标记抗体搭配原则，即弱表达抗原搭配强荧光素标记抗体，强表达抗原搭配弱荧光素标记抗体，同时根据流式细胞仪激光和检测滤片配置，经过多次反复预实验，调整抗体与荧光素的搭配，最终设计了所需抗体与荧光素的搭配、抗体对应克隆号以及检测的细胞亚群（表1）。
表 1 14色流式检测人外周血白细胞亚群方案Table 1. The 14-color panel for flow cytometry of leukocytic subsets in human peripheral bloodSpecificity Fluorochrome Clone Purpose CD45 FITC HI30 Leukocytes CD3 BV510 SK7 T cells CD4 Qdot 655 S3.5 CD4 T cells CD8 PE-Cy7 RPA-T8 CD8 T cells CD19 BV421 HIB19 B cells CD56 BV605 NCAM16.2 NK cells CD16 BUV395 3G8 NK cells/neutrophil cells CD14 Percp-Cy5.5 M5E2 Monocytes CD25 APC M-A251 Treg CD127 PE A019D5 Treg HLA-DR APC-Cy7 L243 DC CD123 BV711 9F5 Plasmacytoid DC/
basophilCD11c APC-R700 3.9 Myeloid DC Viability DAPI － Dead cells NK: Natural killer; DC: Dendritic cell. 1.2.2 样本采集
选取健康成年志愿者18例，年龄20～50岁，中位年龄为35岁。用含有肝素抗凝剂的真空采血管采集志愿者空腹外周静脉血3.0 mL，颠倒混匀，移至离心管中，加入10倍体积的氯化铵红细胞裂解液，室温下裂解红细胞5 min。400×g离心 5 min，弃上清后磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，并用PBS重悬至细胞浓度为1×107 mL−1，备用。本研究经四川大学华西医院生物医学伦理委员会审查批准（2019年审810号）。
1.2.3 抗体质量浓度滴定
将所有抗体依次进行滴定，分别设置抗体的5个工作质量浓度梯度，分别为0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μg/mL，根据抗体原液的质量浓度（200 μg/mL）及反应体系（100 μL）计算对应加入抗体的体积为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μL。
以滴定CD56为例，取5支流式检测管，采用倍比稀释的方法，第1管加入92.0 μL BV stain buffer，其余4管加入50.0 μL。第1管中加入8.0 μL CD56，混匀后吸出50.0 μL加入第2管，混匀后再吸出50.0 μL加入第3管，依次加入至第5管，最后一管弃去50.0 μL混合液。分别向5管中加入50.0 μL已经准备好的其中1例健康成年人细胞悬液，混匀后避光孵育20 min，PBS洗涤后400×g离心5 min。弃上清，3.0 μL PBS重悬细胞后上流式细胞仪检测，收集20 000个Events，Flowjo软件进行分析，计算CD56染色指数（stain index, SI）。SI值越大，阴性与阳性细胞群分离度越大。选择SI值最大的为抗体最适质量浓度。其余抗体滴定依照此方法进行。
1.2.4 电压优化、补偿调节及减一色对照染色
在抗体滴定检测过程中，根据阴性对照背景荧光强度，确定基准电压，在基准电压上依次增加40 V，记录5个不同的电压值，计算SI值，SI值最大为最适电压。在获得抗体最适质量浓度和最适电压后，作单色染色和减一色染色[7]。单色染色是只加入一种抗体或染料，用于调节相应通道的荧光补偿值。减一色染色操作方法为：染色方案中不加入其中一种抗体或染料，其余抗体和染料均需加入，用于设门时更准确确定每个通道阴性和阳性的分界限。
1.2.5 样本检测
根据已经确定好的抗体质量浓度及建立的流式检测方案，对18例健康成年人外周血标本进行检测。预先用BV stain buffer将CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD16、CD14、CD25、CD127、HLA-DR、CD123和CD11c抗体混合，抗体加入量按照最适质量浓度加入。取50.0 μL裂解红细胞后的细胞悬液与50.0 μL混合抗体混匀，室温避光孵育20 min，加入DAPI染色3 min，PBS洗涤后400×g离心5 min，弃上清加入3.0 μL PBS重悬，经流式细胞仪检测，记录106个Events，Flowjo软件分析数据，t-SNE降维分析时，先做FlowAI去除信号不稳定的数据，排除粘连细胞和死细胞，选择CD45+细胞，再用DownSample调整所有样本细胞数量为50 000个，选择不同的细胞群做进一步分析。
2. 结果
2.1 抗体滴定实验
通过计算各个抗体质量浓度的SI值，得到100 μL染色体系中，细胞数量为1×106～2×106 mL−1时，CD25和CD127抗体加入体积为4.0 μL，工作质量浓度为8.0 μg/mL；CD45、CD3、CD14和CD123抗体加入体积为2.0 μL，工作质量浓度为4.0 μg/mL；CD8、CD19、CD56、CD16、HLA-DR和CD11c抗体加入体积为1.0 μL，工作质量浓度为2.0 μg/mL；CD4抗体加入的体积为0.5 μL，工作质量浓度为1.0 μg/mL；DAPI使用质量浓度为0.1 μg/mL。图1A为CD56抗体滴定结果，选择加入1.0 μL可得到抗体最适质量浓度。
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图 1 CD56抗体最适质量浓度的选择（A）和最适电压选择（B）Figure 1. Optimal mass concentration (A) and optimal voltage (B) of CD56 antibody2.2 检测电压优化、补偿调节
通过计算不同电压下的SI值，确定了各个CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD16、CD14、CD25、CD127、HLA-DR、CD123、CD11c抗体和DAPI检测通道的电压分别为：450 V，410 V，400 V，550 V，405 V，500 V，520 V，550 V，550 V，400 V，450 V，400 V，580 V和300 V。图1B为CD56抗体电压滴定结果。补偿调节选择自动补偿调节，自动补偿完成后，再用全部染色的样本再次进行补偿验证和调节。
2.3 样本检测
利用设置好的抗体质量浓度、电压和补偿值，检测18例健康成年人外周血标本，双参数散点图分析主要细胞亚群含量，结果见表2，流式分析过程如图2。图2根据Time参数设门，选择信号稳定的细胞群分析；FSC-A/FSC-H设门，去除粘连体细胞； DAPI阳性为死细胞，DAPI阴性为活细胞；CD45/SSC-A选择CD45+进行后续分析。图3来源CD45+细胞，分别对淋巴细胞群、单核细胞群、粒细胞群设门分析，分别进行中性粒细胞、单核细胞、T细胞和B细胞、调节性T细胞（Treg）分析、NK细胞和NK-T细胞分析。图4来源CD45+细胞，去除T/B细胞、NK、粒细胞和单核细胞，选择HLA-DR+为DC；DC分为髓样DC（myeloid DC, mDC）和浆样DC（plasmacytoid DC, pDC）。t-SNE分析选择DAPI−和CD45++淋巴细胞群，分析结果见图5。图5A为淋巴细胞亚群整体分布，T细胞、B细胞、NK细胞及Treg细胞分群清楚，图5B为除DAPI和CD45后其余12个抗体在淋巴细胞上的表达情况。从图中可以看到，CD3在T细胞表达；CD4和CD8表达量较高，显示红色；CD25主要表达在CD4+；CD127主要在T细胞上表达，但其中一群CD8+显示CD127−；B细胞CD19+；NK细胞CD56弱表达，CD16高表达；HLA-DR主要在CD8+和B细胞上表达；CD11c、CD14、CD123在淋巴细胞上表达均比较弱。
表 2 外周血白细胞主要细胞亚群含量（n=18）Table 2. The percentage of major cell subsets in peripheral blood leukocytes (n=18)Subset in leukocytes (CD45+) Mean/% Min/% Max/% T-cell (CD3+) 38.03 20.89 57.24 T-cell (CD3+CD4+) 20.05 10.57 32.00 T-cell (CD3+CD8+) 14.34 6.83 23.73 Treg cells (CD3+CD4+CD25+CD127－/low) 1.93 0.83 4.47 B-cell (CD19+) 6.58 1.96 13.05 NK cells (CD3－CD56+) 6.12 2.59 13.51 T-cell (CD3+CD56+) 4.85 1.16 11.19 Monocytes (CD14+) 1.68 0.42 4.16 Granulocyte (CD16+) 40.06 15.00 81.81 DC (CD3－CD19－CD56－CD16－CD14－HLA-DR+) 0.43 0.12 1.50 ![]()
图 2 外周血白细胞设门步骤Figure 2. Gating steps for peripheral blood leukocytesCD45+ cells gating strategy: Firstly, cells with stable signals were selected (SSC-A vs. Time). Then single cells were determined (FSC-A vs. FSC-H) and dead cells were excluded. Lastly, CD45+ cells were gated.![]()
图 3 外周血白细胞主要细胞亚群分析方法Figure 3. Analysis of major cell subsets of peripheral blood leukocytesCD45+ was divided into three subsets: Lymphocytes, monocytes and granulocytes. Lymphocytes were divided into B-cell, T-cell and natural killer (NK) cells based on CD19, CD3 and CD56 expression. Different subsets of monocytes were identified on a CD14/CD16 dot plot. The neutrophils were CD16+ in granulocytes.![]()
图 4 DC分析方法Figure 4. Analysis strategy of DCT-cell, B-cell, NK-cell, monocytes and granulocytes were excluded in CD45+ cells. DC was distinguished using HLA-DR, CD123 and CD11c. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) were identified as HLA-DR+CD123+CD11c－; myeloid dendritic cells (mDC) were identified as HLA-DR+CD123－CD11c+.![]()
图 5 淋巴细胞t-SNE分析Figure 5. Analysis of lymphocytes by t-SNEA: The subsets of lymphocytes, including T cell, Treg cell, B cell and NK cell; B: Expression of CD3, CD4, CD25, CD127, CD8, CD19, CD56, CD16, CD11c, CD14, HLA-DR, CD123 on lymphocytes.3. 讨论
近年来，多色流式技术发展迅速。随着流式细胞仪配置的提高，紫外激光、紫激光激发的BUV、BV系列染料的开发促进了多色流式技术的迅速发展。流式细胞术因其准确、方便、快捷和便于标准化，同时在细胞水平进行高通量分析而被科研和临床广泛采用。多色流式具有能够分析更多荧光参数，提供更丰富的生物学信息，对样本进行更加深入的分析，减少样本使用量，节约成本等优势 [8-9]。KATHRYN等[10]建立了一个28色的Panel用于检测人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），全面检测了淋巴细胞中的大部分亚群；LILY等[11]利用全光谱流式细胞仪建立了一个40色的Panel，用于检测外周血中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和DC。这些方案能将细胞表型分得更加深入和细致，但是颜色越多对仪器的配置要求和技术要求均更高，难以推广及临床应用。
本实验建立了在一管中同时加入13种抗体和1种死活细胞染料即可将外周血中白细胞主要亚群分析出来。CD45是白细胞共同抗原，表达强弱顺序为淋巴细胞>单核细胞>粒细胞>幼稚细胞，红细胞和血小板不表达CD45，CD45/SSC双参数设门，将以上几种细胞分别设门分析，并避免红细胞裂解不完全和血小板导致的干扰。CD3是T淋巴细胞表面特异性标记；CD4和CD8分别为辅助性T细胞和杀伤性T细胞。Treg细胞在维持免疫系统稳态和自我耐受方面起着关键作用，在肿瘤免疫中也发挥着重要的作用[12]。Treg表达CD3、CD4、CD25、FoxP3，低或不表达CD127，表面标记可以选择CD25+CD127−/low。FoxP3为核转录因子，需要将细胞固定破膜才可以检测，操作繁琐，因此本方案选择CD25+CD127−/low为Treg细胞[13]。B淋巴细胞表面特异性抗原通常选择CD19或者CD20，CD19在B细胞发育阶段全程表达[14]。NK细胞标记选择CD56和CD16，根据表达强度的不同可以将NK细胞分成五群，CD56++CD16−，CD56+CD16−，CD56++CD16+，CD56+CD16+，CD56−CD16+[15]。CD14为单核细胞表面特异性抗原，可以和CD16一起设门将单核细胞分为CD14+CD16−经典型单核细胞和CD14+CD16+及CD14+CD16++单核细胞[16]。HLA-DR是细胞活化的一个标志，既可以检测T、B细胞的活化情况，同时在DC上也有表达。DC作为抗原递呈细胞，是形成耐受性或促炎性局部免疫环境的关键，越来越多的证据表明，在自身免疫性疾病和癌症进展的背景下研究可能揭示治疗干预的新方法[17]。本方案中DC的检测是将T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞等排除后HLA-DR表达阳性的细胞，利用CD123和CD11c将DC细胞分为pDC和mDC[18]。通过对方案荧光素搭配的不断改进，抗体质量浓度以及电压的优化，建立了稳定的14色方案，共检测了18例健康人外周血中细胞亚群在白细胞中的含量，其平均值和文献报道接近[6]。淋巴细胞t-SNE分析，可以看到淋巴细胞主要细胞亚群T、B、NK细胞等区域分布清晰，同时将这些细胞群的亚群也充分展现出来。如图5A CD8+ T细胞分成了4个亚群，结合图5B各个抗体的表达情况，可以看出这四个亚群在CD127、CD56、HLA-DR表达情况不同；NK细胞群也因为CD8表达差异分成两个亚群。这些亚群在疾病状态下的表达以及功能还需要进一步研究。近些年报道了多篇优化后的流式方案，但大多是某一类细胞亚群的深度分析，如T细胞、B细胞、NK细胞、DC亚群和功能分析等，并没有方案在一管中将外周血白细胞中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、DC等全部检测[19-20]。本实验经过系列优化后的14色方案，双参数散点图能清晰将各个细胞亚群展现出来，t-SNE分析也能清晰展示细胞群各个抗原的表达情况，利于研究疾病状态下的细胞变化情况以及发现新的细胞亚群。该方案主要是细胞表型的分析，细胞功能的分析还未涉及。如果需要分析某些细胞群的功能，可以在此方案的基础上增加或者替换相应的功能分子。
综上所述，本实验建立了稳定的14色流式检测人外周血白细胞亚群方案，细胞分群明显，还可将血液细胞发育及功能分子的检测加入该方案，能够更加完善外周血细胞的状态及功能分析，为研究疾病外周血免疫细胞亚群状态、相关疾病的机制和病程监控提供了一个途径。
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利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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图 1 CD56抗体最适质量浓度的选择（A）和最适电压选择（B）
Figure 1. Optimal mass concentration (A) and optimal voltage (B) of CD56 antibody
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图 2 外周血白细胞设门步骤
Figure 2. Gating steps for peripheral blood leukocytes
CD45+ cells gating strategy: Firstly, cells with stable signals were selected (SSC-A vs. Time). Then single cells were determined (FSC-A vs. FSC-H) and dead cells were excluded. Lastly, CD45+ cells were gated.
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图 3 外周血白细胞主要细胞亚群分析方法
Figure 3. Analysis of major cell subsets of peripheral blood leukocytes
CD45+ was divided into three subsets: Lymphocytes, monocytes and granulocytes. Lymphocytes were divided into B-cell, T-cell and natural killer (NK) cells based on CD19, CD3 and CD56 expression. Different subsets of monocytes were identified on a CD14/CD16 dot plot. The neutrophils were CD16+ in granulocytes.
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图 4 DC分析方法
Figure 4. Analysis strategy of DC
T-cell, B-cell, NK-cell, monocytes and granulocytes were excluded in CD45+ cells. DC was distinguished using HLA-DR, CD123 and CD11c. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) were identified as HLA-DR+CD123+CD11c－; myeloid dendritic cells (mDC) were identified as HLA-DR+CD123－CD11c+.
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图 5 淋巴细胞t-SNE分析
Figure 5. Analysis of lymphocytes by t-SNE
A: The subsets of lymphocytes, including T cell, Treg cell, B cell and NK cell; B: Expression of CD3, CD4, CD25, CD127, CD8, CD19, CD56, CD16, CD11c, CD14, HLA-DR, CD123 on lymphocytes.
表 1 14色流式检测人外周血白细胞亚群方案
Table 1 The 14-color panel for flow cytometry of leukocytic subsets in human peripheral blood
Specificity Fluorochrome Clone Purpose CD45 FITC HI30 Leukocytes CD3 BV510 SK7 T cells CD4 Qdot 655 S3.5 CD4 T cells CD8 PE-Cy7 RPA-T8 CD8 T cells CD19 BV421 HIB19 B cells CD56 BV605 NCAM16.2 NK cells CD16 BUV395 3G8 NK cells/neutrophil cells CD14 Percp-Cy5.5 M5E2 Monocytes CD25 APC M-A251 Treg CD127 PE A019D5 Treg HLA-DR APC-Cy7 L243 DC CD123 BV711 9F5 Plasmacytoid DC/
basophilCD11c APC-R700 3.9 Myeloid DC Viability DAPI － Dead cells NK: Natural killer; DC: Dendritic cell. 
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表 2 外周血白细胞主要细胞亚群含量（n=18）
Table 2 The percentage of major cell subsets in peripheral blood leukocytes (n=18)
Subset in leukocytes (CD45+) Mean/% Min/% Max/% T-cell (CD3+) 38.03 20.89 57.24 T-cell (CD3+CD4+) 20.05 10.57 32.00 T-cell (CD3+CD8+) 14.34 6.83 23.73 Treg cells (CD3+CD4+CD25+CD127－/low) 1.93 0.83 4.47 B-cell (CD19+) 6.58 1.96 13.05 NK cells (CD3－CD56+) 6.12 2.59 13.51 T-cell (CD3+CD56+) 4.85 1.16 11.19 Monocytes (CD14+) 1.68 0.42 4.16 Granulocyte (CD16+) 40.06 15.00 81.81 DC (CD3－CD19－CD56－CD16－CD14－HLA-DR+) 0.43 0.12 1.50
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