腺病毒是引起人呼吸道感染的主要病原体之一，感染人的腺病毒分为A～G 7个血清学组。人腺病毒（HAdV）目前已发现有100多个亚型别（http://hadvwg.gmu.edu/），HAdV感染的临床表现主要包括发烧、呼吸系统疾病、肠胃炎和结膜炎，在免疫功能低下的患者中，可能导致呼吸衰竭、弥漫性感染、出血性膀胱炎、神经系统疾病以及死亡^[1-2]。在我国引起呼吸系统感染的腺病毒主要有3、7、11、14、55型等，引起肠道感染的主要有40和41型，但也有HAdV-3、7等其他型别腺病毒引起腹泻的报道^[3-4]。

腺病毒55型（HAdV-55）由HAdV-11和14型重组而来^[5]。自2006年首次报道以来，HAdV-55感染在我国时有发生，目前已有15个省（市、自治区和直辖市）分离出HAdV-55病毒^[6]。2016−2019年，在西藏、云南和四川等地区的军营中每年都有HAdV-55感染病例的发生，规模较大时可引起数百名士兵的感染^[7-8]。最近流行的HAdV-55毒株具有高度的基因组同源性，但也发现了一些可能影响感染性和传播性的基因突变^[9]。我们前期对四川、西藏等地分离培养的毒株基因序列进行了分子进化分析，发现HAdV-55基因序列相对稳定，在十几年的流行期间仅发生了个别位点的基因突变^[8,10]。HAdV-55主要引起呼吸系统感染，典型症状为发热、咳嗽、咽痛，约半数患者可发展为肺炎^[11]，2019年报道了中国安徽一宗HAdV-55引起的致命性急性呼吸道家庭聚集感染病例，其中一位55岁的感染者死亡^[12]。目前尚未见HAdV-55引起腹泻的临床报道，也未见HAdV-55对肠道细胞感染性的相关研究报道。本研究主要以人结直肠腺癌细胞Caco-2为模型，探讨HAdV-55对肠道细胞的感染性，分析HAdV-55的感染特性，并为开发口服疫苗提供参考。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

人喉癌上皮细胞HEp-2、人结直肠腺癌细胞Caco-2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。GIBCO胎牛血清（FBS）、DMEM、1640培养基、青/链霉素、AP标记山羊抗小鼠IgG购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒、One Step qRT-PCR Kit (Probe)购自天根生化科技（北京）有限公司；引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。

腺病毒毒株HAdV-3、7、14、55均分离自感染者咽拭子标本，咽拭子标本均采集自部队上呼吸道感染病例，采用细胞分离培养法在生物安全2级实验室进行毒株分离培养，具体方法为：接种HEp-2细胞于24孔板，待细胞密度达到70%，弃去细胞培养基，以PBS洗涤细胞3次，加入含2%FBS的DMEM培养基300 μL及咽拭子标本150 μL，37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中孵育6 h，更换为500 μL含2%FBS的DMEM培养基，逐日观察细胞病变情况。当75%以上的细胞出现病变时，收集上清，利用型特异性引物通过荧光定量PCR方法进行病毒鉴定，连续培养3代后分装保存，以Reed-Muench法计算病毒对HEp-2细胞的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀），以荧光定量PCR方法定量病毒拷贝数。所用引物和探针如下（5′-3′），HAdV-3F：GGGAGACAATATTACTAAAGAAGGTTTGC；HAdV-3R：CAACTTGAGGCTCTGGCTGATA；HAdV-3P：FAM-CACTAC“T*”GAAGGAGAAGAAAAGCCCATTTATGCC（T*处标记BHQ1，3′末端磷酸化修饰）；HAdV-7F：GAGGAGCCAGATATTGATATGGAATT；HAdV-7R：AATTGACATTTTCCGTGTAAAGCA；HAdV-7P：FAM-AAGCTGCTGACGCTTTTTCGCCTGA-BHQ1；HAdV-14F：GAAAATCATGGTGTGGAAGATGAA；HAdV-14R：CAAGCTTGGTCTCCATTTAACTGA；HAdV-14P：FAM-ACGGCATCGGTCCGCGAACA-BHQ1；HAdV-55F：CGGAGCAGCCAAATCAGAA；HAdV-55R：CATGAGTGTCTGGAGTTTCCAAAT；HAdV-55P：FAM-TGCGGCATCACAGAAAACAAACTTAAGTC-BHQ1。

1.2   免疫荧光检测（immunofluorescent assay, IFA）抗HAdV-55小鼠血清孵育的Caco-2细胞内HAdV-55病毒蛋白的表达

抗HAdV-55小鼠血清由前期实验获取^[13]，简要程序为：HAdV-55在0.1%甲醛、60 ℃条件下热灭活12 h，将灭活后的腺病毒毒液与弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合，充分乳化，皮下注射BABL/c小鼠，免疫3次，每次间隔2周，末次免疫1周后采集小鼠血清。

接种Caco-2细胞于96孔板内，接种密度1×10⁴/孔，培养24 h后，每孔加入含HAdV-55的培养基，病毒感染量为1 MOI，6 h后，更换为不含病毒的新鲜培养液。以不感染病毒的细胞培养孔作为对照。48 h后弃去培养上清，PBS洗涤2次，加入甲醇100 μL/孔，−20 ℃固定20 min，PBS洗涤1次，加入3%BSA 100 μL/孔，室温封闭2 h；PBS洗涤1次，加入抗HAdV-55小鼠血清或对照小鼠血清（1∶200稀释）100 μL/孔，室温孵育2 h；PBS洗涤3次，加入Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG（1∶500稀释）100 μL/孔，室温避光孵育1 h；PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察拍照，定性观察Caco-2细胞内病毒蛋白的表达（绿色荧光为阳性）。

1.3   细胞培养与感染

Caco-2细胞培养于含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的1640培养液，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。

接种Caco-2细胞于48孔板内，接种密度0.5×10⁵/孔，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h，弃去培养孔内培养基，PBS洗涤细胞3次。每孔加入500 μL 含不同病毒株HAdV-3、7、14、55的2%FBS 1640培养基，用感染复数（multiplicity of infection, MOI）为1的病毒量（即1 MOI）感染细胞，感染后6 h，更换为不含病毒的新鲜培养液，感染后不同时间点（1 d、3 d、5 d）收集细胞和上清，通过荧光定量PCR检测病毒DNA水平。

1.4   荧光定量PCR检测HAdV-55 DNA在细胞内的表达

采用Tiangen病毒RNA/DNA提取试剂盒提取细胞或上清液中的腺病毒DNA，具体操作参照说明书进行。建立HAdV-55 DNA检测的标准曲线，对提取的腺病毒DNA水平进行定量检测。以提取的病毒DNA为模板，采用Tiangen One Step qRT-PCR Kit (Probe)进行病毒DNA检测，反应体系为：模板5 μL、2×RT-qPCR mix 12.5 μL、Taq酶 0.5 μL、上游引物Adv-F 0.5 μL、下游引物Adv-R 0.5 μL、探针Adv-probe 0.5 μL、ddH₂O 5.5 μL；反应程序为：预变性 95 ℃ 1 min，变性94 ℃ 5 s、退火55 ℃ 10 s、延伸72 ℃ 15 s，循环40次。所用引物和探针序列如下（5′-3′），Adv-F：CGGAGCAGCCAAATCAGAA；Adv-R：CATGAGTGTCTGGAGTTTCCAAAT；Adv-probe：TGCGGCATCACAGAAAACAAACTTAAGTC。

1.5   病毒感染致细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）检测

接种Caco-2细胞于48孔板内，接种密度0.5×10⁵/孔，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h，弃去培养孔内培养基，PBS洗涤细胞3次。每孔加入500 μL含不同病毒株的2%FBS 1640培养基，病毒感染滴度为100×TCID₅₀和1×TCID₅₀，感染后6 h，更换为不含病毒的新鲜培养液，持续观察细胞生长情况，72 h后倒置显微镜下观察并拍照。

1.6   细胞上清的感染性检测

按照1.3的方法感染Caco-2细胞，感染后5 d收集细胞上清。接种腺病毒敏感细胞系HEp-2细胞于48孔板内，接种密度0.5×10⁵/孔，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h。弃去培养孔内培养基，PBS洗涤细胞1次，更换为新鲜培养基，每孔加入20 μL Caco-2细胞上清，6 h后，更换为不含病毒的新鲜培养液，感染48 h收集HEp-2细胞，提取HEp-2细胞内病毒DNA，通过荧光定量PCR检测病毒DNA水平。

1.7   统计学方法

计量数据以$\bar{x}\pm s$表示。多组间差异采用单因素方差分析，两组间比较采用Tukey检验，α=0.05。

2.   结果

2.1   HAdV-55感染Caco-2细胞内病毒蛋白的表达

如图1所示，HAdV-55感染48 h后Caco-2细胞，经抗HAdV-55小鼠血清孵育后，细胞内病毒蛋白表达为阳性，经对照小鼠血清孵育后，细胞内病毒蛋白表达为阴性。未感染HAdV-55的对照组Caco-2细胞，两种小鼠血清孵育后，细胞内病毒蛋白表达均为阴性。结果提示，HAdV-55成功入侵Caco-2细胞，细胞内有HAdV-55病毒蛋白的表达。

图  1  免疫荧光检测感染细胞内病毒蛋白的表达。 ×100

Figure  1.  Detection of viral protein in infected cells by immunofluorescence. ×100

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2.2   腺病毒在细胞内的复制增殖

由图2A可见，HAdV-3、7、14、55在Caco-2细胞内均能持续复制和增殖，细胞内病毒DNA水平随感染时间的增加而升高。由图2B所示，感染的Caco-2细胞上清中，病毒DNA水平持续增长。另外，感染细胞内各检测时间点HAdV-55 DNA水平明显高于HAdV-3和HAdV-7，上清中HAdV-55病毒DNA水平在感染后3d和5d明显高于HAdV-3、7和14型。

图  2  荧光定量PCR检测病毒DNA水平（n=3）

Figure  2.  Detection of viral DNA levels via qPCR (n=3)

A: Viral DNA level in the cell; B: Viral DNA level in the supernatant.

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2.3   感染细胞上清中感染性病毒颗粒检测

荧光定量PCR结果显示，Caco-2感染后5 d的上清感染的HEp-2细胞内可以检测到腺病毒DNA，说明Caco-2细胞上清中含有感染性病毒颗粒，能够成功感染HEp-2细胞。图3示，Caco-2上清中HAdV-55感染性病毒颗粒高于HAdV-3、7和14，差异有统计学意义（P<0.05）。

图  3  Caco-2上清对HEp-2细胞的感染性 （n=3）

Figure  3.  Infectivity of Caco-2 supernatant to HEp-2 cells (n=3)

*P<0.05, vs. HAdV-3, HAdV-7, and HAdV-14.

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为进一步明确HAdV-55对Caco-2的感染性是否高于另外三者，我们采用小剂量病毒感染Caco-2，72 h后观察细胞CPE情况。采用100×TCID₅₀的病毒感染Caco-2细胞，HAdV-3、7、14和55均能引起明显的CPE（结果未示）。而采用1×TCID₅₀的病毒感染Caco-2细胞，感染72 h后细胞CPE情况见图4，HAdV-55感染孔出现典型CPE和病毒空斑，HAdV-3、7和14感染孔细胞与对照组差异不明显。

图  4  1×TCID₅₀腺病毒感染Caco-2细胞72 h后的CPE效应。 ×100

Figure  4.  CPE effect of different types of 1×TCID₅₀ adenovirus on Caco-2 cells. ×100

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3.   讨论

目前腺病毒感染没有特效药物及疗效显著的治疗方法，主要依靠机体自身免疫系统消灭病毒而痊愈。腺病毒疫苗是预防腺病毒感染的有效方法，目前中国的一些学者也开始进行腺病毒疫苗的相关基础研究^[14-15]，包括重组多价疫苗的开发，但尚未见临床前研究，说明短时期内国内没有可用的人腺病毒疫苗上市。世界上经批准的腺病毒疫苗只有仅限美军内部使用的口服HAdV-4/HAdV-7疫苗，通过口服途径减毒，能够有效降低部队腺病毒引起的呼吸道感染疾病的发生率^[16]。口服疫苗主要通过诱导肠道黏膜免疫反应，保护机体抵抗病原体的攻击。探讨病毒对肠道细胞的感染性，对其开发为口服疫苗具有指导作用。我们前期对HAdV-55的免疫原性进行了相关研究，发现灭活的HAdV-55病毒通过皮下注射免疫小鼠能够诱导较高的中和抗体^[13]，我们也对HAdV-55病毒口服免疫小鼠进行了初步探讨，口服免疫能够诱导小鼠产生体液免疫反应，利用免疫小鼠血清进行体外中和实验，对HAdV-55感染HEp-2细胞具有阻断作用。

另一方面，一些感染呼吸道的腺病毒可引起肠道系统感染。陈银桥等^[17]调查武汉地区2015年5−8月腺病毒引起的急性腹泻的情况，发现腺病毒阳性率为15.90%（14/88），其病毒株主要为HAdV-41型，占75.14%，此外也有HAdV-7（21.43%）、HAdV-31（14.29%）以及HAdV-3（7.14%）。孙灵利等^[3]调查了北京市朝阳区2011−2017年5岁以下腹泻患儿腺病毒分子流行病学特征，64例腺病毒阳性标本中，HAdV-41型为最主要的型别，占70.31%。其次依次为HAdV-31型（6.25%）、HAdV-40型（4.69%）、HAdV-1型（3.13%）、HAdV-5型（3.13%）、HAdV-6型（3.13%）、HAdV-7型（3.13%）、HAdV-2型（1.56%）、HAdV-3型（1.56%）、HAdV-4型（1.56%）和HAdV-61型（1.56%）。陈惠芳在其硕士学位论文中，调查了引起婴幼儿腹泻的主要病毒，发现25例腺病毒阳性中，HAdV-41占80%（20/25），为主要流行株，其余为非肠道腺病毒HAdV-7（16%，4/25）和HAdV-5（4%，1/25）^[4]。国外也有这方面的相关报道，ÇOLAK等^[18]对土耳其5岁以下儿童腺病毒腹泻调查发现，HAdV-41为主要毒株，占64%（16/25），其次分别为HAdV-40（24%，6/25）、HAdV-31（8%，2/25）以及HAdV-7（4%，1/25）。由上述这些研究可以看出，我国引起腹泻的腺病毒最主要的是HAdV-41型，其他非肠型的呼吸道感染腺病毒，如HAdV-7、HAdV-3等也可引起肠道感染，但尚未见腹泻标本中检测到HAdV-55的报道。

本实验主要观察了HAdV-55对肠道细胞的感染性，结果提示HAdV-55对肠道细胞具有较高的感染性，并且高于HAdV-3、7和14型，但综合国内的研究可以看出，尚未见病毒性腹泻中HAdV-55的报道，其原因一方面可能与HAdV-55在我国的总体流行率低有关。另一方面也可能是由于所用检测引物的局限性，而将其误归于HAdV-11或14型。但近几年我们通过监测呼吸道病原体感染情况发现，我国西部地区，尤其是四川省，HAdV-55感染每年均有发生，而且阳性率高于其他引起呼吸道感染的腺病毒亚型（HAdV-3、7型等），因此今后仍需加强西部地区病毒性腹泻腺病毒的监测和病毒分型。

另外本研究结果明确了HAdV-55对肠道细胞的易感性，提示其能够诱导肠道黏膜免疫应答，可制作成口服疫苗。但其对肠道细胞的感染性高于HAdV-3、7型等，利用野生型HAdV-55毒株进行口服免疫是否会产生较高的肠道感染副反应等，也是今后研究需要明确的重点问题之一。