口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是最常见的头颈部恶性肿瘤，约占口腔恶性肿瘤的90%^[1-2]。OSCC的常规治疗方法包括手术治疗、放疗和化疗等。随着人们对肿瘤发生机制的深入研究，基于致癌基因的分子靶向治疗已成为当前肿瘤治疗的新选择^[3-4]。

蛋白激酶D（protein kinase D, PKDs）是一类钙离子/钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括PKD1、PKD2及PKD3三个家族成员^[5]。研究发现，PKDs在多种肿瘤细胞中异常表达，通过不同信号传导路径参与肿瘤的侵袭、转移、增殖、分化及蛋白运输等生物学过程^[6-7]，如PKDs可被G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）激动剂、生长因子、佛波酯等激活，参与细胞信号转导^[8]；甘油二酯（diacylglycerol, DAG）通过磷酸化作用调节细胞内PKDs的定位，并通过蛋白激酶C（protein kinase C, PKCs）激活PKDs^[9]。PKDs的表达和功能具有组织特异性，如PKD1在正常乳腺导管上皮细胞中高表达，而在高侵袭乳腺癌细胞中表达下调^[10-11]，而PKD2和PKD3在高侵袭乳腺癌细胞中上调表达^[12]。目前关于PKDs在OSCC中的表达及其与OSCC分化的关系的报道还较少，因此本研究对40例OSCC组织样本中PKD1、PKD2及PKD3的表达及其与OSCC分化程度的关系进行了探索，旨在分析PKDs在OSCC发生、发展中的作用，为靶向治疗OSCC提供新的参考。

1.   材料和方法

1.1   组织标本信息

本研究经四川大学华西口腔医院医学伦理委员会严格审查并批准（批准号：WCHSIRB-D-2013-039），在患者知情同意的情况下开展本研究。收集2016年6月−2018年12月在四川大学华西口腔医院口腔颌面外科手术切除、并经病理检查确诊的40例OSCC患者的病理组织标本。其中男25例，女15例；平均年龄58岁，最高年龄74岁，最小年龄26岁；高分化OSCC患者15例，中分化OSCC患者15例，低分化OSCC患者10例。正常组为10例同期非OSCC手术切除的正常口腔上皮组织，其中男6例，女4例。

1.2   试剂和仪器

兔多克隆抗PKD1一抗（CST公司，美国），兔多克隆抗PKD2一抗和兔多克隆抗PKD3一抗（SAB公司，美国），兔抗体免疫组化SP试剂盒（凯基生物公司，中国），柠檬酸钠抗原修复液（谷歌生物公司，中国），中性塑胶（索莱宝科技有限公司，中国），组织石蜡包埋机 Microm EC 350-2（Microm公司，德国），石蜡切片机LeicaRM2235和烤片机 Leica HI1220（Leica公司，德国），病理切片扫描机Aperio ScanScope GL（Aperio公司，美国）。

1.3   免疫组化检测PKD1、PKD2和PKD3蛋白表达

将收集的组织标本在体积分数为4%的多聚甲醛中固定24 h后石蜡包埋，蜡块经石蜡切片机制备成5 μm厚的组织切片；将组织切片置于65 ℃恒温箱中烘烤3 h；经二甲苯（15 min）、二甲苯（15 min）、无水乙醇（5 min）、无水乙醇（5 min）、950 mL/L乙醇（5 min）、900 mL/L乙醇（5 min）、850 mL/L乙醇（5 min）、800 mL/L乙醇（5 min）、750 mL/L乙醇（5 min）的顺序脱蜡和水化后，用PBS洗3次，每次5 min；用现配的体积分数为3%的H₂O₂室温孵育切片15 min，PBS洗3次，每次5 min；用1×柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）微波修复15 min，自然冷却至室温，PBS洗3次，每次5 min；按照免疫组化SP试剂盒说明书，滴加山羊血清60 μL，37 ℃恒温箱中孵育30 min；分别滴加1∶50稀释的PKD1、1∶100稀释的PKD2、1∶200稀释的PKD3一抗，使之完全覆盖组织，4 ℃过夜；将组织从4 ℃冰箱中取出后37 ℃复温1 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加二抗60 μL，37 ℃孵育1 h；PBS清洗玻片3次，每次5 min，滴加现配的DAB染色液，镜下控制染色时间；自来水终止染色，后用0.3%苏木素复染组织30 s，蒸馏水洗3次，每次2 min；再用盐酸酒精分化10 s，蒸馏水洗3次，每次2 min；按750 mL/L乙醇、800 mL/L乙醇、850 mL/L乙醇、900 mL/L乙醇、950 mL/L乙醇、无水乙醇、二甲苯的顺序对组织进行脱水和透明；滴加中性塑胶封片并镜检。

1.4   结果判定标准

免疫组化结果分析采用半定量计分法，由两位不知病理信息的研究人员独立观察每张切片，在100倍镜下随机选取5个视野，对细胞染色强度和阳性细胞比例分别计分，用细胞染色强度和阳性细胞比例的乘积代表PKDs表达强度。染色强度计分标准：无染色计0分，浅黄色计1分，中黄色计2分，深黄色计3分，深褐色计4分；阳性细胞比例计分标准：无阳性细胞或阳性细胞<5%计0分，阳性细胞占比5%~25%计1分，阳性细胞占比26%~50%计2分，阳性细胞占比51%~75%计3分，阳性细胞占比≥76%计4分。

1.5   统计学方法

两组数据差异性分析采用单因素方差分析，采用Spearman分析进行PKDs与OSCC间的相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   PKD1、PKD2和PKD3在不同分化程度OSCC组织中的免疫组化染色结果

见图1。PKD1蛋白主要在细胞质中表达，少量在细胞核中表达。PKD1在OSCC组织中的表达高于正常口腔上皮组织，且在分化程度不同的OSCC组织中表达存在差异。统计结果（表1）显示，PKD1在高分化OSCC组织中的表达强度得分为5.67±1.76，在中分化OSCC组织中的表达强度得分为8.00±3.69，在低分化OSCC组织中的表达强度得分为11.30±3.64，表明PKD1在低分化OSCC组织中的表达高于高分化OSCC（P<0.001）。PKD2主要在细胞质中表达，在正常口腔上皮组织中不表达，在高分化OSCC组织中表达量极低，在中分化和高分化OSCC组织中有少量表达。PKD3在细胞质和细胞核中均有表达，在OSCC组织中的表达高于正常口腔上皮组织，且在中分化和低分化OSCC组织中的表达较高，均高于高分化OSCC（P<0.001）。

图  1  PKD1、PKD2和PKD3在不同分化程度OSCC组织中的免疫组化染色结果（标尺=100 μm）

Figure  1.  The immunohistochemical staining of PKD1, PKD2 and PKD3 in diverse differentiation OSCC tissues (scale bar=100 μm)

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表  1  PKD1、PKD2和PKD3在高分化、中分化及低分化OSCC组织中的免疫组化染色评分及其与OSCC分化程度的相关性

Table  1.  The immumohistochemical (IHC) score of PKD1, PKD2 and PKD3 in well differentiated OSCC, moderately differentiated OSCC and poorly differentiated OSCC, and the correlation between the IHC score of PKDs with the differentiation of OSCC

Differentiation degree	n	PKD1				PKD2				PKD3			P
		IHC score	r	P		IHC score	r	P		IHC score	r	P
Well differentiated	15	5.67±1.76	−0.574	<0.001		1.11±1.17	−0.341	<0.001		6.89±2.41	−0.073	0.389	<0.001
Moderately 　differentiated	15	8.00±3.69				1.24±1.75				7.11±3.55*			<0.001
Poorly differentiated	10	11.30±3.64*				3.00±1.94				7.63±3.32*			<0.001
*P<0.001, vs. well differentiated.

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2.2   相同分化程度OSCC组织中，PKD1、PKD2及PKD3染色评分之间的差异性

统计结果发现，在相同分化程度的OSCC组织中，PKD1、PKD2及PKD3的免疫组化染色评分差异均有统计学意义（P<0.001）（表1）。

2.3   PKD1、PKD2和PKD3免疫组化染色评分与OSCC分化程度之间的相关性

结果显示（表1），PKD1免疫组化染色评分与OSCC组织分化程度呈负相关（r=−0.574, P<0.001），表明OSCC组织分化程度越低，PKD1的表达越高；PKD2免疫组化染色评分与OSCC组织分化程度呈负相关（r=−0.341, P<0.001），即PKD2在分化程度越低的OSCC组织中表达越高；PKD3免疫组化染色评分与OSCC组织分化程度无相关关系（r=−0.073, P=0.389）。

3.   讨论

OSCC是口腔癌中最常见的类型，据研究报道，每年约有50万新增的OSCC病例^[13]，近年来其发病率有逐年增高的趋势^[14]。OSCC易发生侵袭、转移，预后较差，晚期OSCC患者的5年生存率仅为40% ~50%^[13]，OSCC患者的生活质量和生命安全受到了极大的危害^[2]。目前，OSCC的常规临床治疗方法主要包括手术治疗、放化疗等，但这些方法对晚期肿瘤患者的疗效并不理想。因此，OSCC的治疗重点已经转向靶向治疗，特别是针对基因水平上肿瘤细胞的增殖和凋亡。

PKDs家族成员结构高度同源，均包含一个碳端结构域、一个PH结构域和一个富含半胱氨酸的DAG氮端结构域。PH结构域对PKDs的催化作用具有负调节作用，此结构域的缺失会导致PKDs的持续激活^[15-17]。PKDs在细胞迁移^[18]，细胞增殖^[19]，蛋白质转运^[20]，上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及细胞侵袭^[21]，血管生成^[22]等多种生物学行为中发挥重要作用。PKDs的功能具有组织特异性，如PKD1在胰腺癌中上调表达^[23]，在胃癌中表达量降低^[24-25]；PKD2和PKD3在乳腺癌中和前列腺癌中均上调表达^[26-30]。

本研究以40例分化程度不同的OSCC组织和10例正常口腔上皮组织为研究对象，利用免疫组化技术，分析了PKDs的表达。实验结果显示，PKDs在OSCC组织中表达的部位存在差异，PKD1和PKD2主要在细胞质中表达，PKD3在细胞质和细胞核中均有表达，且分化程度越低的OSCC组织中PKD3在细胞核的表达越高，提示在不同分化程度的OSCC中，PKD3可能通过调节其在核中的定位来发挥不同的生物学功能；其次，PKDs在分化程度不同的OSCC组织中，表达量存在差异，PKD1、PKD2和PKD3在中分化和低分化OSCC组织中的表达均高于其在高分化OSCC组织中表达；此外，研究还发现，同一分化程度下，PKD1、PKD2及PKD3仍存在明显差异。以上结果显示，PKDs的3个亚型PKD1、PKD2和PKD3存在功能上的差异，它们在不同细胞或者相同肿瘤细胞的不同分化程度中，发挥独特的功能；PKDs在细胞内定位的差异，可能是导致其功能差异的重要因素。已有研究显示，与正常前列腺组织相比，前列腺癌组织中PKD1和PKD3的表达量显著升高，并且随着肿瘤恶性程度的增加，PKD3在核中的定位显著增加^[26-27]。也有研究表明，PKD1在正常乳腺导管上皮细胞中高表达，而在高侵袭乳腺癌细胞中表达下调^[10-11]，而PKD2和PKD3在高侵袭乳腺癌细胞中上调表达，表明三者在高侵袭乳腺癌中发挥不同作用，PKD1在乳腺癌的发生发展中起抑制作用，而PKD2和PKD3通过促进细胞迁移、增殖和多药耐药性等对乳腺癌的发生起促进作用^{[12, 28, 31-33]}。另有研究表明，PKD2和PKD3在人角质细胞的生长和增殖中发挥相反作用^[33]。此外，研究还发现PKDs的功能取决于其在细胞内的定位和胞内环境，定位在膜上的PKDs可以诱导转基因小鼠中CD4和CD8的表达，而细胞质中的PKDs会抑制T细胞中Vβ到DJβ的重组^[34]。

此外，本研究还发现，PKD1和PKD2的表达与OSCC组织的分化程度呈负相关关系，OSCC分化程度越低，PKD1和PKD2的表达越高，表明PKDs在肿瘤细胞的分化过程中起重要的调节作用。

综上所述，我们推测PKDs在OSCC的生长、分化等过程中发挥重要作用，但三者的功能也存在一定的差异，这为OSCC患者的治疗提供了新的靶点。同时也提示，治疗不同分化程度的OSCC，应选择不同的PKDs家族蛋白进行靶向治疗。