细菌感染是根尖周炎重要的致病因素，也是根尖周炎迁延不愈的主要原因。粪肠球菌为革兰阳性兼性厌氧菌，是难治性根尖周炎的主要致病菌^[1]。研究发现治疗失败的根尖周炎患者根管内粪肠球菌的检出率比原发性感染根管高出约9倍^[2]。由于粪肠球菌具有较强的生物膜形成能力和多重耐药性，对常规的根管抗菌药物及消毒方法有较强的抵抗力和耐受力^[3]。在牙本质小管中处于饥饿状态的粪肠球菌具有更强的耐药性，难以将其从结构复杂的根管系统内彻底清除^[4]。因此，如何对抗粪肠球菌感染成为目前牙髓根尖周病治疗研究中的热点。

黄连素又名小檗碱，是黄连、黄柏等天然药物中提取的异喹啉类生物碱，具有良好的抗菌、抗炎和调节骨代谢作用^[5-6]。研究发现，黄连素对粪肠球菌具有一定的抗菌效果，但抗菌效果较其它根管抗菌药物无明显优势且最小抑菌浓度（MIC）偏高（≥500 mg/L）^[7-9]。黄连素与其它抗菌药物联用，可增强黄连素的抗菌活性，减少抗菌药物用量，延缓耐药菌株的产生^{[5, 10-11]}。关于黄连素协同作用的研究已经有很多报道，然而目前关于黄连素与戊间甲酚（用于治疗口腔炎症的低毒性消毒药物）两者联合应用抗菌的研究还未见报道。本研究探讨黄连素与戊间甲酚联合使用对粪肠球菌的抗菌效果，以期为难治性牙髓根尖周病的临床治疗提供新思路。

1.   材料与方法

1.1   试剂、菌株和设备

盐酸黄连素（berberine hydrochloride，APEXBIO，以下简写BBH），白色粉末，溶于体积分数为40%乙醇；戊间甲酚（amylmetacresol，上海易势化工有限公司，以下简写AMC），棕色液体，溶于体积分数40%乙醇，本研究中母液质量分数为0.233%，参考成品药“使立消润喉喷雾（Strepsils+Plus Anaesthetic Throat Spray）”，此浓度符合使用安全；粪肠球菌（Enterococcus faecalis ATCC 19433，口腔疾病研究国家重点实验室中国口腔微生物资源库提供）；牛脑心浸出液（BHI，BD）；CCK-8试剂盒（Dojindo）；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（Dojindo）；SYTO 9，Propidium Iodide（Life Technologies）。扫描电子显微镜（FEI）；激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP2）。人口腔黏膜上皮角质细胞（HOK，口腔疾病研究国家重点实验室）；稀释液（1.0 g胰蛋白胨和8.5 g氯化钠溶解于1 000 mL蒸馏水，121 ℃，15 min）；有机干扰物（30 g牛血清白蛋白溶于1 000 mL蒸馏水，过滤除菌）；中和剂（D/E中和肉汤34.0 g和5.0 g吐温−80溶解于1 000 mL蒸馏水，121 ℃，15 min）。

1.2   黄连素最小抑菌浓度（MIC）测定

将512 μg/mL BBH稀释于BHI培养基，分别制备1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL 10个质量浓度梯度的含黄连素BHI培养基，以等体积40%乙醇（体积分数）和BHI作为阴性对照。过夜复苏粪肠球菌，1∶10稀释于BHI培养基后培养至600 nm波长下的光密度（OD₆₀₀）=0.5～0.6，再次用上述含不同质量浓度梯度的黄连素BHI培养基1∶100稀释，于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养24 h后测定OD₆₀₀，以完全抑制细菌生长（OD₆₀₀约为0）的最低药物质量浓度为MIC。

1.3   戊间甲酚MIC测定

按照《消毒技术规范》（2002年版）要求^[12]，过夜复苏粪肠球菌，1∶10稀释于BHI培养基后培养至1×10⁸～5×10⁸ CFU/mL，离心收菌，并用稀释液重悬，形成菌悬液。取0.5 mL菌悬液和0.5 mL有机干扰物质混合形成混合液Ⅰ。室温静置5 min，取质量分数为0.223%、0.023 3%、0.002 33%、0.000 233%AMC梯度稀释液各4.0 mL注入混合液Ⅰ，同时以等体积PBS和体积分数为40%乙醇为阴性对照，此时各组所得液体统称为混合液Ⅱ。30 s后分别吸取0.5 mL混合液Ⅱ于4.5 mL无菌中和剂混匀，终止AMC的杀菌活性。10 min后，各取0.2 mL涂布于BHI固体培养皿，24 h后观察细菌生长状况，最终以完全抑制细菌生长时的最低AMC浓度为MIC。

1.4   悬液定量杀菌试验

按照《消毒技术规范》（2002年版）要求^[12]，过夜复苏粪肠球菌，1∶10稀释于BHI培养基后培养至1×10⁸～5×10⁸ CFU/mL，离心收菌并用稀释液重悬，形成菌悬液。取0.5 mL菌悬液和0.5 mL有机干扰物质混合形成混合液Ⅰ。室温静置5 min，各取4.0 mL不同组合的消毒液（PBS、体积分数40%乙醇、质量分数0.233%AMC、质量分数0.002 33%AMC、512 μg/mL BBH、512 μg/mL BBH+质量分数0.002 33%AMC）分别注入混合液Ⅰ静置30 s，此时各组得到的液体为混合液Ⅲ，然后各取0.5 mL混合液Ⅲ分别加入4.5 mL无菌中和剂混匀。10 min后，各取0.2 mL涂布于BHI固体培养皿，培养24 h后进行CFU计数。

1.5   粪肠球菌生物膜中的杀菌效果检测

将过夜复苏的粪肠球菌1∶10稀释于BHI培养基后培养至OD₆₀₀=0.5～0.6，再用BHIG（BHI+2%葡萄糖）进行1∶100稀释，并取1 mL稀释液于含无菌玻璃片的24孔板中培养24 h。加不同组合的消毒液（同1.4）室温孵育生物膜30 s，再用PBS冲洗后用死活染料标记死活细菌，SYTO 9标记活菌，PI标记死菌，染色15 min后于激光共聚焦显微镜下观察各组药物在生物膜中的杀菌效果，并用COMSTAT 2.1对相对荧光值进行统计分析。

1.6   扫描电子显微镜观察粪肠球菌生物膜结构的稳定性

用不同组合的消毒液（同1.4）处理生物膜30 s，再用PBS冲洗后并固定于体积分数为2.5%戊二醛4 ℃过夜，再进行乙醇梯度脱水（体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%），每次15 min，干燥后喷金，于扫描电镜下观察。

1.7   CCK-8细胞增殖毒性检测

接种HOK细胞密度约为5 000 /孔，24 h后分别加入BBH梯度液（0、16、32、64、128、256、512 μg/mL）、AMC梯度液（0、1∶10⁶，1∶10⁵，1∶10⁴，1∶10³，1∶10²，1∶10）、BBH+AMC混合梯度液的两倍浓缩液，30 s后更换新鲜培养基，再加10 μL CCK-8液孵育2 h并测定450 nm处的OD值。细胞存活率（cell viability, %）=〔(实验孔OD₄₅₀值−空白孔OD₄₅₀值)/(对照孔OD₄₅₀值−空白孔OD₄₅₀值)〕×100%

1.8   乳酸脱氢酶细胞毒性检测

接种HOK细胞密度约为5 000 /孔，24 h后分别加入BBH梯度液（0、16、32、64、128、256、512 μg/mL）、AMC梯度液（0、1∶10⁶，1∶10⁵，1∶10⁴，1∶10³，1∶10²，1∶10）、BBH+AMC混合梯度液的两倍浓缩液，30 s后更换5%FBS培养基，在高对照孔加入10 μL裂解液，孵育0.5 h，在每孔中加入100 μL工作液，室温避光孵育30 min，待高对照孔与低对照孔OD值差>0.2后，每孔加入50 μL终止液，测定490 nm处的OD值。细胞损伤率（cytotoxicity, %）=〔(样品OD₄₉₀值−低对照孔OD₄₉₀值)/(高对照孔OD₄₉₀值−低对照孔OD₄₉₀值)〕×100%。

1.9   统计学方法

以上实验均重复3次，每次重复实验均设置3组平行对照。组间差异使用单因素方差分析（ANOVA）进行检验比较，两两差异用Student's t test进行检验比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   黄连素与戊间甲酚对粪肠球菌具有协同抗菌作用

MIC实验结果发现：512 μg/mL BBH能够完全抑制粪肠球菌生长，即黄连素的MIC为512 μg/mL（图1A）。质量分数0.023 3%AMC能够完全抑制粪肠球菌生长，即AMC的MIC为0.023 3%（图1B）。从图中可看出，体积分数40%乙醇对粪肠球菌无明显抗菌作用。此外，质量分数0.223%AMC的抗菌效果较强，质量分数分别为0.002 33%和0.000 233%AMC对粪肠球菌抑制效果不明显（图1B）。

图  1  黄连素（A）和戊间甲酚（B）的MIC测定

Figure  1.  The MIC determination of berberine hydrochloride (BBH, A) and amylmetacresol (AMC, B)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

进一步通过悬液定量杀菌试验来检测BBH与AMC对粪肠球菌的杀灭效果。结果发现，512 μg/mL BBH和质量分数0.002 33%AMC分别单独使用时，粪肠球菌能够生长，表明单独使用时对其杀灭效果较弱，但二者联合使用时，粪肠球菌生长受抑制，表明二者表现出协同抗菌作用（图2A和2B）。

图  2  悬液定量杀菌试验结果

Figure  2.  The results of quantitative suspension test

A: The representative pictures of antibacterial effect on different drugs treatment; B: The CFU counting of antibacterial effect on different drugs treatment (n=3, *P<0.05).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   黄连素和戊间甲酚联用对生物膜状态的粪肠球菌杀灭效果不明显

图3结果表明，与对照组PBS相比，体积分数40%乙醇、512 μg/mL BBH、质量分数0.002 33%AMC和512 μg/mL BBH+质量分数0.002 33%AMC组绿色荧光强度稍有下降，红色荧光强度稍有增加，但差异无统计学意义。其次，质量分数0.233%AMC组绿色荧光强度最弱，红色荧光强度最强，差异有统计学意义（P<0.05）。表明单用高浓度（质量分数0.233%）AMC可以达到在生物膜中的杀菌效果，但512 μg/mL BBH与低浓度（质量分数0.002 33%）AMC，无论单用还是联用，对成熟生物膜中细菌的杀灭效果不明显。

图  3  激光共聚焦显微镜观察各组死活菌比例

Figure  3.  The ratio of living/dead bacteria observed by Laser confocal microscope

A: Living/dead‐labeling representative images of different antibacterial drugs treating biofilm of E. faecalis (SYTO9, green showing live bacteria; PI, red showing dead bacteria; Merge showing combination of SYTO9 and PI channel); B: The fluorescence value analyzed by COMSTAT 2.1 (n=3, *P<0.05, vs. PBS).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   黄连素和戊间甲酚联用影响粪肠球菌生物膜结构的稳定性

如图4所示，PBS、体积分数40%乙醇、512 μg/mL BBH和质量分数为0.002 33%AMC组生物膜中细胞排列紧密，生物膜结构稳定；而质量分数为0.233%AMC组和512 μg/mL BBH+质量分数为0.002 33%AMC组生物膜中出现“细小裂纹”（白色箭头处），生物膜结构松散，表明二者联用或适当提高AMC浓度可以破坏粪肠球菌生物膜结构的稳定性，促进药物进入生物膜内部杀灭细胞，有利于提高药物的抗菌效果。

图  4  扫描电子显微镜观察生物膜结构。 ×8 000

Figure  4.  The structure of biofilm observed by SEM. ×8 000

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   黄连素和戊间甲酚（单用或联用）作用HOK细胞毒性较低

质量分数0.233%AMC 1∶10稀释液（即质量分数为 0.023 3 %）作用于HOK细胞时，活细胞数较少（图5A），死细胞数较多（图5B），细胞存活率和损伤率分别为42.3%和20.7%（图5C），此时质量分数0.023 3%AMC存在明显的细胞毒性，而其余浓度无明显细胞毒性。512 μg/mL BBH处理HOK细胞时，活细胞数稍有减少（图5D），死细胞数无明显变化（图5E），细胞存活率和损伤率分别为76.7%和0.9%（图5F），此时512 μg/mL BBH存在较小的细胞毒性，而其余质量浓度无明显细胞毒性。将512 μg/mL BBH和质量分数0.02 33%AMC联合处理HOK细胞时，活细胞数较多（图5G），未见明显死细胞（图5H），细胞存活率和损伤率分别为80.3%和0%（图5I），表明此时512 μg/mL BBH和质量分数0.02 33%AMC联合应用时无细胞毒性，其余浓度梯度的混合物也无明显细胞毒性。

图  5  CCK-8和LDH检测细胞毒性

Figure  5.  The determination of cytotoxicity by CCK-8 kit and LDH assay kit

A, D and G showed viable cells were detected after treating of different antibacterial drugs. B, E, and H showed damaged cells were detected after treating of different antibacterial drugs. C, F, and I showed cell viability and cytotoxicity were analyzed after treating of different antibacterial drugs.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

粪肠球菌是近年来被广泛研究的难治性牙髓根尖周病的关键致病菌^[13]。关于黄连素协同作用的研究已有很多报道，如吴莉萍等^[14]研究发现黄连素和左氧氟沙星联用对金黄色葡萄球菌具有协同抗菌作用。相比单用黄连素，黄连素和青霉素类抗生素联用对多重耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌效果更强，同时也减少抗生素的用量，一定程度上可降低细菌对抗生素耐药性的产生^[10]。本研究结果亦表明，相比单用质量分数为0.002 33%AMC或质量分数为512 μg/mL BBH，两者联用时对浮游状态的粪肠球菌具有更好的杀菌作用，由于AMC的MIC为0.02 33%，此时表明0.002 33%AMC和512 μg/mL BBH联用具有协同抗菌作用。尽管其具体机制不清楚，我们推测其可能原因是二者形成某种中间产物，而该产物对粪肠球菌的杀灭效果更强。

细菌生物膜是某些致病菌重要的毒力因子，对抗生素及机体免疫力有着天然的抵抗能力。相关研究表明，生物膜状态的细菌对抗生素的抗性是浮游状态细菌的10～1 000倍^[15]，可能原因是生物膜的物理屏障作用、抗菌药物相关分解酶增多和耐药基因易水平传递等^[16]。本研究也表明，黄连素和戊间甲酚无论是单用还是联用对生物膜状态的粪肠球菌杀灭效果均不明显，但适当提高戊间甲酚的浓度可增强杀灭效果。此外，扫描电子显微镜观察生物膜中出现“细小裂纹”，其可能原因是戊间甲酚和黄连素反应的中间产物有降解生物膜胞外基质的作用，但具体机制还有待进一步研究。

在原发性根管与根管治疗失败的根管内粪肠球菌的生存状况存在着明显的差异，提示该菌与根管治疗失败后造成复发性根尖周炎的关系密切相关^[17]。目前根管消毒的常用药物有氢氧化钙、氯己定和次氯酸钠等，但也存在诸多缺陷和不足。如粪肠球菌对氢氧化钙具有一定的耐受能力^[18]；氯己定的抗菌活性具有浓度依耐性^[19]；次氯酸钠缺乏对残留细菌的抗菌活性。本研究中黄连素与戊间甲酚的联用不仅可表现出协同抗菌效果，且两者低剂量的联合使用仍能发挥较好的抗菌效果，无明显细胞毒性。由于黄连素是我们日常生活中的常见药物，戊间甲酚也是某些含漱液的主要成分，二者联用具有广阔的开发应用前景，可为临床控制口腔粪肠球菌感染提供新策略。