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Inhibition of Copper Transporter-1 by Ammonium Tetrathiocarbolybdate in the Treatment of Pancreatic Cancer
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摘要:目的 检测胰腺癌细胞、原位异种移植的原位胰腺癌小鼠模型和临床胰腺癌组织标本中铜转运蛋白1（copper transporter 1, CTR1）的表达，并验证铜螯合剂四硫代钼酸铵（ammonium tetrathiomolybdate, TM）通过调控胰腺癌细胞中CTR1的表达对胰腺癌的抑制效果。方法 采用免疫组化法检测22例临床胰腺导管癌及距肿瘤0.5~1 cm的癌旁组织标本中CTR1和抗氧化蛋白1（ATOX1）的表达情况。采用PANC-1细胞构建5只原位胰腺癌裸鼠模型，收集胰腺癌组织中及对应的正常胰腺组织，免疫组化法检测CTR1和ATOX1的表达情况，与临床标本进行比较。采用10、30、50、100 μmol/L TM处理人胰腺癌细胞株PANC-1 24 h、48 h、72 h后，使用CCK-8法检测细胞增殖情况；50 μmol/L TM处理PANC-1 24 h、48 h后，划痕实验检测PANC-1细胞侵袭能力变化；10、30、50、100 μmol/L TM处理PANC-1 48 h后，Western blot检测CTR1、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和细胞周期蛋白CyclinD1的表达。采用PANC-1细胞建立裸鼠皮下荷瘤模型，分别给予不同剂量TM（0.3 mg/d，1.0 mg/d）灌胃24 d后，观察肿瘤生长情况。结果 免疫组化结果提示，22例临床胰腺导管癌患者组织标本中，19例（86.36%）出现CTR1高表达，且在PANC-1裸鼠原位移植瘤组织中CTR1同样高表达。使用TM处理PANC-1细胞后，细胞增殖抑制程度随着TM剂量的升高、处理时间的延长而逐渐增强；细胞迁移能力下降；胞内CTR1、VEGF和CyclinD1的表达均随着TM剂量的升高而降低。PANC-1荷瘤裸鼠在给予不同剂量TM后，肿瘤生长出现抑制，TM高剂量组的肿瘤体积和肿瘤质量减小更为明显（P<0.05）。结论 胰腺癌中CTR1表达异常增高，针对这一靶点使用铜螯合剂治疗可能有助于抑制胰腺癌生长迁移。Abstract:Objective To examine copper transporter 1 (CTR1) expression in pancreatic carcinoma cells, orthotopic xenograft pancreatic tumor model and clinical samples, and verify the effect of copper chelating agent ammonium tetrathiomolybdate (TM) regulate the expression of CTR1 in pancreatic carcinoma cells and the inhibition of pancreatic carcinoma.Methods The expressions of copper transporter CTR1 and antioxidant protein 1 (ATOX1) in 22 clinical pancreatic ductal carcinoma and paracancer tissues 0.5-1 cm away from the tumor were measured by immunohistochemistry (IHC). PANC-1 cells were used to construct 5 orthotopic xenograft pancreatic tumor of nude mice models. Pancreatic cancer tissues and corresponding normal pancreatic tissues were collected, and the expressions of CTR1 and ATOX1 were detected by IHC and compared with clinical tissues. The proliferation of pancreatic carcinoma cells PANC-1 treated with 10, 30, 50, 100 μmol/L TM for 24 h, 48 h, 72 h was measured by CCK8 assay. The migration abilities of PANC-1 cells treated with 50 μmol/L TM for 24 h, 48 h were detected by scratch test. The expressions of CTR1, vascular endothelial growth factor (VEGF) and CyclinD1 proteins in PANC-1 cells treated with 10, 30, 50, 100 μmol/L TM for 48 h were measured by Western blot. Then the subcutaneous tumor-bearing model of nude mice were established with PANC-1 cells, and the growth of tumor was observed after oral administration of 0.3 mg/d and 1.0 mg/d of TM, respectively.Results The immunohistochemical results indicated that 19 of the 22 clinical pancreatic ductal cancer tissues of carcinoma patients had high expression of CTR1, and the same high expression of CTR1 was found in the orthotopic transplanted tumor tissues of PANC-1 nude mice. The proliferation inhibition of PANC-1 cells increased with the concentration of TM increased and the treatment time prolonged. The expressions of intracellular CTR1, VEGF and CyclinD1 all decreased with the concentration of TM increased. The cell migration ability decreased after the PANC-1 cells treated with TM. The tumor growth of PANC-1 tumor-bearing nude mice was inhibited after different doses of TM were delivered. The reduction in tumor volume and weight was more pronounced in the high-dose TM group (P<0.05).Conclusion The expression of CTR1 is abnormally elevated in pancreatic carcinoma, and treatment with copper chelating agent for this target may help to inhibit pancreatic carcinoma.
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Keywords:
- Pancreatic cancer /
- Copper transporter 1 /
- Ammonium tetrathiomolybdate
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乳腺癌是一种激素依赖性的全身性疾病[1]，对于中晚期老年乳腺癌患者，延长寿命、提高生活质量最为重要，建议选择机体损伤小、全身反应轻的治疗方法，使用激素药物进行辅助内分泌治疗正是这样一种选择[2-4]。
绝经后的女性卵巢已不再分泌雌激素，其雌激素主要是由肾上腺、脂肪、肌肉等性腺外组织的雄激素经芳香化酶转化而来[5]，而雌二醇主要是由雄烯二酮在外周组织中的芳香化酶复合物的作用下转化为雌酮，雌酮随后转化为雌二醇[6]。降低乳腺癌妇女循环中的雌二醇水平有利于治疗。阿那曲唑为一种高选择性、高效的第三代非甾体类芳香化酶抑制剂，通过抑制绝经后女性患者肾上腺中生成的雄烯二酮转化为雌酮，进而降低血浆雌激素水平，从而抑制乳腺肿瘤的生长，同时阿那曲唑对肾上腺皮质类固醇或醛固酮的生成没有明显影响，可以用作绝经后晚期乳腺癌患者内分泌一线治疗药物，能够有效提高疾病客观缓解率和延长疾病进展时间[7]。多个临床试验结果也都表明，在乳腺癌辅助治疗领域第三代芳香化酶抑制剂的疗效已经超过三苯氧胺，且不良反应的发生率更低[8-12]，适用于绝经后妇女的晚期乳腺癌的治疗。
扬子江药业集团有限公司生产的阿那曲唑片已获得国家食品药品监督管理总局(CFDA)生产批件(国药准字H20050328)，现根据CFDA要求进行上市后药物一致性评价。
1. 对象和方法
1.1 对象
本研究包括空腹和餐后给药两个生物等效性试验，每个试验分别纳入24例已自然绝经或人工绝经的女性。要求雌二醇(E2)＜20 pg/mL，卵泡刺激素(FSH)＞40 mIU/mL；年龄18~65周岁；体质量≥50 kg，体质指数(BMI)在19~28 kg/m2范围内。志愿者在试验前签署知情同意书，体格检查、血尿常规、肝肾功能、心电图、腹部B超、妇科B超、胸片等检查等合格后参加试验。志愿者在试验前14 d及试验期间未服用其他任何药物，试验期间禁烟酒或含咖啡因的饮料。试验方案经四川大学华西第二医院临床试验伦理专业委员会批准，批件号：Y2017001-01。
1.2 给药方案与血样采集
空腹及餐后预试验Cmax、AUC0-t及AUC0-inf的个体内变异系数(CV)均小于10%，按照Intra-subject CV=10%来估算正式试验的样本量。假设受试制剂和参比制剂的几何均数比值为1.05，双单侧α=0.05，检验效能β=90%，假设正式试验中空腹试验和餐后试验各需要8例可评估的受试者，根据指导原则[13]规定，可评价的受试者数目不应小于18例，考虑20%的脱落率，正式试验空腹试验和餐后试验则应至少各入组24例受试者。空腹试验时1例受试者在第Ⅰ周期给药前主动退出，未服用药物；4例受试者因发生了“不符合入选标准第一条：E2＜20 pg/mL，FSH＞40 mIU/mL”的严重方案偏离，经数据审核会讨论剔除，不纳入PK和BE数据集。餐后试验中有2例受试者在第Ⅰ周期给药前退出，未服用药物；有2例受试者因发生了“不符合入选标准第一条：E2＜20 pg/mL，FSH＞40 mIU/mL”的严重方案偏离，经数据审核会讨论剔除，不纳入PK和BE数据集。
空腹组和餐后组为两个独立的试验。志愿者随机分配接受受试制剂或参比制剂的顺序，清洗期为15 d。给药前1 d志愿者统一食用标准晚餐，保持空腹10 h以上，次日依照给药随机表，服用相应受试制剂或参比制剂。
空腹组给药当日清晨约8:00志愿者空腹口服受试制剂或参比制剂1 mg，用240 mL温开水送服。用药前1 h内和用药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、6、9、12、24、48、72、96、120、144、168 h采集静脉血约4 mL至含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中。全血样本2~5 ℃、2 700×g离心6 min，分离上层血浆保存在(-70±10) ℃冰箱中。
餐后给药试验当日清晨志愿者进食高脂餐。进餐30 min后用240 mL温开水吞服1 mg受试制剂或参比制剂。用药前1 h内和用药后0.33(20 min)、0.67(40 min)、1、2、3、4.5、5、5.5、6、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h采集静脉血约4 mL。其他的试验要求与空腹给药试验一致。
1.3 药品与试剂
阿那曲唑片：受试制剂商品名艾达，扬子江药业集团有限公司生产，规格1 mg/片，批号：16090611，有效期2018年8月；参比制剂：商品名瑞宁得，阿斯利康制药有限公司生产，规格1 mg/片，批号：HC0236，有效期2021年3月。
阿那曲唑对照品，购自TRC，批号为5-GBH-105-1，纯度为98.0%，复检日期为2019年7月12日。内标阿那曲唑-d12标准品采购自TRC，批号为5-GBH-105-1，纯度为98.0%，复检日期为2019年7月12日。
流动相用甲醇为色谱纯，实验用水为Millipore水处理系统产生的超纯水。
1.4 仪器与色谱质谱条件
采用日本岛津公司的Prominence, 20 Series；美国AB公司，API4000三重四级杆串联质谱仪。色谱柱为Phenomenex, GeminiⓇ5 μm C18 110A(50 mm×2 mm)。流动相：A泵为0.1%甲酸水溶液，B泵为甲醇。流速为0.6 mL/min。柱温：40 ℃，进样器温度设置为5 ℃。
质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)；喷雾器电压3 000 V；温度500 ℃；入口电势(EP)10 V；喷雾气(N2)压力75 psi；碰撞气(N2)压力8 psi；气帘气体(N2)压力40 psi；正离子方式检测；用于定量分析的离子反应分别为质荷比(m/z) 294.0→225.1(阿那曲唑)、m/z 306.1→237.2(阿那曲唑d12)。
1.5 血浆样品处理
50 μL血浆样品加入50 μL质量浓度为15 ng/mL的内标工作液，再加500 μL的乙腈后加盖涡旋混匀5 min，3 000×g离心5 min后，转移150 μL上清液加入150 μL 0.1%甲酸水溶液，加盖涡旋混匀2 min，进样5 μL。
1.6 方法学评价
1.6.1 选择性
测定含有内标的空白基质、不含内标的空白基质、试剂空白和6个空白基质样本，考察阿那曲唑的响应值；考察空白基质、试剂空白、仅添加阿那曲唑的ULOQ样品在内标峰区域是否有明显干扰。
1.6.2 基质效应
6个不同来源的空白基质，提取后加入分析物和内标配制成低浓度质控(LQC)和高浓度质控(HQC)样品进样浓度，进样后记录峰面积；按LQC和HQC样品进样浓度配制的纯溶液(包含内标)，进样后记录峰面积，分别计算6个不同来源基质样品中分析物和内标归一化基质效应(ISTD)的基质效应。
1.6.3 标准曲线与定量下限(LLOQ)
连续3 d配制质量浓度0.500、1.00、3.00、8.00、20.0、40.0、90.0、100 ng/mL的血浆样品，按“1.5血浆样品处理”项下操作；以阿那曲唑质量浓度作横坐标(x)，阿那曲唑与内标的峰面积比(R)作纵坐标(y)，加权(1/x2)最小二乘法回归运算。
1.6.4 精密度与回收率
配制50 μL阿那曲唑质量浓度为0.50、1.50、7.50、40.00、80.00 ng/mL的最低定量限(LLOQ)、LQC、低中浓度质控(LMQC)、中浓度质控(MQC)和HQC血浆质控样本各6份，连续测定3批，根据测定结果计算方法精密度。按“1.5血浆样品处理”方法处理LQC、MQC和HQC各3个样品，进样记录峰面积，另外提取9个空白基质样品，用提取后的空白基质配制成浓度LQC、MQC和HQC的回收率样品进样，记录峰面积，两者峰面积之比求得回收率。
1.6.5 稳定性
考察全血样品稳定性，全血样品配制成LMQC浓度并在37 ℃孵育10 min后被分装，并分别在分装即时(t0)、室温放置2 h(t2RT)和湿冰上放置2 h(t2WI)3个时间点后收集制成血浆样品，每个时间点至少包含3个重复样品。血浆样品按“1.5血浆样品处理”后按照分析方法进行测定，测定峰面积比率(分析物/内标)与零时刻对照样品进行比较，如果峰面积比率的准确度在85.0%~115%范围内，则认为稳定性可接受，则认为稳定性可接受。
另外，配制LQC和HQC的血浆样品考察在-10~-30 ℃及-60~-80 ℃条件下保存176 d、在-10~-30 ℃及-60~-80 ℃条件下反复冻融5次、在室温放置24 h时的稳定性，样本按“1.5血浆样品处理”制备后的，在2~8 ℃条件下放置72 h进行测定。
1.6.6 溶血和高脂样品的评价
在空白血浆中加入2%全血配制成溶血空白基质，用溶血空白基质配制LQC和HQC的溶血样本各6个。使用同一批次的天然高脂血(三酰甘油质量浓度≥300 mg/dL)配制成LQC和HQC的高脂样品各6个。计算平均准确度须在85.0%~115.0%范围内。
1.7 统计学方法
使用Phoenix WinNonlin 6.3版中的非房室模型分析，计算药代动力学参数。
本研究使用SAS 7.1版本，将主要药代动力学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞进行对数转换后进行方差分析(ANOVA)，制剂组别、周期、序列组别作为固定效应，受试者作为随机效应。计算对数变换后的药代动力学参数的受试制剂和参比制剂的最小二乘法均值(LSM)、几何均值比值(受试制剂/参比制剂)及其90%CI。此外在方差分析的基础上进行双单侧t检验。α=0.05。
Tmax使用Hodges-Lehmann检验(Hodges-Lehmann’s median analysis)对未变换值进行非参数分析，计算出差的中位数(受试制剂-参比制剂)及其90%CI。
采用置信区间法进行生物等效性评价。若受试制剂与参比制剂药代参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞几何均值比率(受试制剂/参比制剂)的90%置信区间均落在80.00%~125.00%范围内，则可判断为受试制剂与参比制剂生物等效[14]。
2. 结果
2.1 方法学评价结果
2.1.1 选择性
阿那曲唑和内标的保留时间为1.52 min、1.59 min；在含有内标的空白基质、不含内标的空白基质、试剂空白和6个空白基质样本中，阿那曲唑的响应值≤平均LLOQ响应的20.0%；在空白基质、试剂空白、仅添加阿那曲唑的ULOQ样品中，在内标峰区域未见明显干扰(≤零浓度样品内标响应的5.0%)，表明阿那曲唑的选择性符合要求。
2.1.2 基质效应
分别计算6个不同来源的基质样本中分析物和内标的基质效应因子和内标归一化基质效应。结果阿那曲唑基质效应因子和内标归一化基质效应见表 1，由此可见内标归一化基质效应的%CV值均≤15.0%。
表 1 6个不同来源空白血浆的基质效应因子及内标归一化基质效应样品 基质效应因子 内标基质效应因子 内标归一化基质效应因子 LQC x±s 0.964±0.018 0.980±0.011 0.984±0.020 %CV 1.8 1.2 2.1 HQC x±s 0.996±0.005 0.998±0.004 0.998±0.007 %CV 0.5 0.4 0.7 2.1.3 标准曲线与定量下限
3 d内制备的标准曲线分别为y=0.082 6x-0.000 791，r2=0.999 4；y=0.078 6x+0.001 40，r2=0.999 5；y=0.077 1x+0.001 25，r2=0.999 1。标准曲线各点偏差均符合要求，r2均＞0.99表明阿那曲唑标准曲线在0.500~100 ng/mL浓度范围内线性关系良好，准确测定的LLOQ为0.500 ng/mL。
2.1.4 精密度、准确度和回收率
阿那曲唑5个浓度的质控样本的日内精密度相对标准偏差(RSD)为0.70%~6.30%，日间RSD为1.40%~5.40%，具体结果见表 2。阿那曲唑日内准确度偏差为-5.00%~4.00%，日间准确度偏差为-3.80~2.30。LQC、MQC和HQC的平均回收率分别为92.9%、100.1、102.5%，内标回收率为100.9%。
表 2 方法学评价精密度结果理论质量浓度/(ng/mL) 日内平均质量浓度(ng/mL) 日内精密度RSD/% 日间平均质量浓度/(ng/mL) 日间精密度RSD/% 1批次 2批次 3批次 1批次 2批次 3批次 0.500 0.517 0.497 0.506 6.30 4.80 5.30 0.507 5.40 1.50 1.55 1.51 1.53 1.60 2.00 3.20 1.53 2.40 7.50 7.55 7.45 7.61 1.50 0.70 1.90 7.53 1.70 40.0 40.8 40.2 41.6 1.70 2.10 1.40 40.9 2.10 80.0 77.9 76.0 77.3 1.10 0.80 1.20 77.0 1.40 2.1.5 稳定性
全血样品在t2RT与t0比峰面积比率的准确度为100.5%，在t2WI与t0比峰面积比率的准确度为101.8%。
血浆样品在不同稳定性条件下的测定浓度与t0样本浓度比较，在-10~-30 ℃保存176 d LQC的RSD为3.3%、HQC的RSD为4.0%；在-60~-80 ℃条件下保存176 d LQC的RSD为2.2%、HQC的RSD为3.1%；在-10~-30 ℃条件下反复冻融5次LQC的RSD为2.4%、HQC的RSD为2.9%；在-60~-80 ℃条件下冻融循环5次LQC的RSD为1.5%、HQC的RSD为2.6%；血浆样品室温放置24 h LQC的RSD为1.7%、HQC的RSD为3.3%；制备后血浆样品在2~8 ℃条件下放置72 h LQC的RSD为1.5%、HQC的RSD为1.9%。
2.1.6 溶血和高脂样品的评价结果
在含有2%溶血全血的人血浆中LQC平均准确度为99.3%，HQC的平均准确度为100.3%；在≥300 mg/dL三酰甘油水平的人血浆中LQC平均准确度为98.7%，HQC的平均准确度为100.9%，溶血和高脂样品的平均准确度均在85.0%~115.0%范围内。
2.2 血药浓度-时间曲线
空腹状态下19例受试者单次口服1 mg阿那曲唑片的受试制剂与参比制剂后血药浓度-时间曲线见图 1；餐后试验20例受试者单次口服1 mg阿那曲唑片受试制剂或参比制剂后血药浓度-时间曲线见图 2，主要药代参数均值见表 3，可见空腹和餐后状态下阿那曲唑试验制剂与参比制的体内过程一致，空腹组试验于服药后约1 h达峰浓度，餐后组试验于服药后约3 h达峰浓度。空腹组的Cmax略高于餐后组，AUC0-t和AUC0-∞较接近。
表 3 中国健康绝经期女性志愿者口服1 mg试验制剂和参比制剂后阿那曲唑主要药动学参数参数 空腹组(n=19) 餐后组(n=20) 试验制剂 参比制剂 试验制剂 参比制剂 Cmax/(ng/mL) 18.53±2.60 18.64±2.92 14.34±2.68 14.04±2.04 Tmax*/h 1.00(0.73, 2.50) 1.00(0.75, 2.00) 3.75(1.98, 11.90) 3.00(0.98, 6.00) AUC0-t/(h·ng/mL) 748.10±132.43 751.10±110.26 761.83±106.33 745.38±83.82 AUC0-∞/(h·ng/mL) 795.76±148.52 804.69±136.30 821.54±121.03 809.14±108.88 t1/2/h 38.85±5.80 40.96±6.91 42.27±8.29 44.88±8.36 λz/(1/h) 1.83×10-2±2.99×10-3 1.74×10-2±3.14×10-3 1.71×10-2±3.68×10-3 1.60×10-2±3.08×10-3 *中位数(最小值，最大值) 2.3 生物等效性评价
中国健康绝经期女性志愿者在空腹和餐后状态下口服1 mg阿那曲唑片受试制剂与参比制剂后，血浆中阿那曲唑的主要药代动力学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的几何均数比值90%置信区间见表 4，由表 4可知阿那曲唑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞个体内变异小于8%，个体内变异较小。本研究的阿那曲唑无论是空腹状态还是餐后状态的几何均数比值90%置信区间均落在可接受的等效范围(80.00%~125.00%)内，符合生物等效性判断标准，说明其与对照品为生物等效制剂。
表 4 生物等效性评价结果组别 参数 几何均数比值 个体内差异/% 90%CI 把握度/ % 试验制剂 参比制剂 (T/R)/% 空腹组 Cmax/(ng /mL) 18.40 18.27 100.71 6.86 96.85~104.73 100 AUC0-t/(h·ng/mL) 740.31 743.27 99.60 5.22 96.68~102.62 100 AUC0-∞/(h·ng/mL) 786.26 793.39 99.10 5.05 96.29~102.00 100 餐后组 Cmax/(ng /mL) 14.11 13.90 101.50 7.97 97.16~106.02 100 AUC0-t/(h·ng/mL) 754.72 741.06 101.84 5.31 98.88~104.89 100 AUC0-∞/(h·ng/mL) 812.88 802.49 101.30 5.76 98.15~104.54 100 T/R:试验制剂/参比制剂 2.4 安全性评价
空腹试验共入组24例受试者，23例进入安全性数据集(SAS)，其中有11例受试者发生了18例次不良事件，10例受试者发生的17例次治疗中的不良事件。服用受试制剂后有6例受试者发生7例次不良事件，不良事件发生率为(26.1%)，其中2例受试者发生2例次不良事件与药物可能有关；服用参比制剂后有6例受试者发生10例次不良事件，不良事件发生率为(26.1%)，其中有2例受试者发生3例次不良事件与药物可能有关。除参比制剂组有1例受试者发生2例次严重程度为2级的胃肠系统不良事件(恶心、腹胀)外，其余不良事件均为轻度。
餐后试验共入组24例受试者，22例进入安全性分析集(SAS)。共有5例受试者共发生5例次不良事件，其中4例受试者发生的4例次为治疗中不良事件，均发生在参比制剂组，治疗中不良事件发生率为18.2%。所有不良事件均判为与药物无关，在试验结束时均已痊愈。除1例受试者发生皮疹严重程度为2级外，其他不良事件均为1级。
所有不良事件均观察至恢复正常。本次临床研究未发生严重不良事件。除不良事件所报道的情况外，各周期生命体征、心电图及实验室检查未见有临床意义异常。受试制剂阿那曲唑片与对照品单次空腹给药1 mg剂量在中国健康绝经后期女性受试者中安全性良好。
3. 讨论
考虑到不同的制剂处方工艺不同，食物对其释放和吸收的影响程度可能也不同。本研究进行了空腹和餐后生物等效性研究，结果显示餐后试验阿那曲唑达峰时间约3 h、峰浓度均约14 ng/mL、峰面积约800 h·ng/mL；空腹试验达峰时间1.00 h、峰浓度18 ng/mL、峰面积约800 h·ng/mL，符合说明书报道的“食物影响吸收速度，但不影响吸收程度，进餐后阿那曲唑的平均Cmax降低16%，Tmax延迟2~5 h”。本研究的国产阿那曲唑无论是空腹状态还是餐后状态的几何均数比值90%置信区间均落在生物等效性可接受的等效范围(80.00%~125.00%)内，可认为本品与参比制剂(原研药品)质量和疗效具有一致性。
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图 1 免疫组化检测CTR1和ATOX1在临床胰腺癌组织标本中的表达情况（标尺=200 μm）
Figure 1. The expressions of CTR1 and ATOX1 in clinical tissue samples stained by IHC (scale bar=200 μm)
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图 2 免疫组化检测CTR1和ATOX1在原位胰腺癌裸鼠模型中的表达情况（标尺=200 μm，白色箭头所指处为PANC-1肿瘤）
Figure 2. The expressions of CTR1 and ATOX1 proteins in PANC-1 xenografted tumor from nude mice stained by IHC (scale bar=200 μm. White arrow points out the tumor site)
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图 3 TM对PANC-1细胞增殖的抑制作用（n=3）
Figure 3. Inhibitory effect of TM on PANC-1 cell proliferation (n=3)
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, vs. DMSO (0 μmol/L TM) at the same time; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, vs. 24 h at the same concentration; +P<0.05, +++P<0.001, vs. 48 h at the same concentration.
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图 4 TM对胰腺癌细胞迁移能力的抑制作用（×10，n=3）
Figure 4. The inhibitory effect of TM on the migration and invasion of pancreatic cancer cells (×10, n=3)
*** P<0.001.
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图 5 TM对CTR1、VEGF和CyclinD1表达的下调作用（n=3）
Figure 5. The down-regulation effect of TM on the expressions of CTR1, VEGF and CyclinD1 (n=3)
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, vs. DMSO group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.
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图 6 TM对PANC-1裸鼠皮下肿瘤生长的抑制作用（n=4）
Figure 6. The inhibitory effect of TM on the subcutaneous tumor growth of PANC-1 nude mice (n=4)
* P<0.05, vs. other groups; #P<0.05, # # P<0.01.
表 1 TM的稀释
Table 1 Dilute the TM
Solution Final concentration/(mmol/L) 10 30 50 100 Stock solution/μL 2 6 10 20 RPMI1640/μL 98 94 90 80 
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