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The Effects and Mechanisms of Dihydroartemisinin on Influenza A Virus H1N1 Induces TNF-α and IL-6 Expression in Bronchial Epithelial Cells
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摘要:目的 探讨双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）对甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）A/PR/8/34（H1N1）诱导人支气管上皮细胞（BEAS-2B）促炎症因子和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路蛋白表达的影响。方法 采用不同浓度的DHA（即0、12.5、25、50和100 μmol/L）作用BEAS-2B细胞24 h ，CCK8法检测DHA对BEAS-2B细胞活性的影响。IAV吸附BEAS-2B细胞1 h ，分别采用不同浓度的DHA（低、中、高浓度DHA ，即12.5、25和50 μmol/L）作用24 h，同时设置正常对照组和IAV组。采用实时荧光定量PCR法（real time quantitative PCR, RT-qPCR）和酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分别检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）的mRNA和蛋白表达水平，蛋白质印迹法（Western blot）检测磷酸化ERK（phospho-ERK, p-ERK）蛋白表达水平。采用特异性ERK激动剂（ERK agonist，20 ng/mL）作用BEAS-2B细胞（分组为正常对照、IAV、DHA、DHA+IAV、ERK agonist、DHA+IAV+ERK agonist组）24 h，观察对DHA抑制IAV诱导BEAS-2B细胞TNF-α、IL-6和p-ERK表达的影响。结果 DHA浓度在12.5、25、50 μmol/L时，BEAS-2B细胞存活率与正常对照组比较差异无统计学意义；与正常对照组比较，IAV组细胞TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白及p-ERK蛋白表达水平增高 (P<0.05)，与IAV组比较，IAV+ DHA低、中、高浓度组细胞TNF-α、IL-6 mRNA和TNF-α、IL-6、p-ERK蛋白表达水平呈剂量依赖性的下降(P<0.05)；而ERK激动剂减弱了DHA抑制IAV诱导BEAS-2B细胞ERK信号通路蛋白p-ERK表达和促炎症因子TNF-α、IL-6的分泌。结论 DHA可通过ERK信号通路抑制IAV诱导BEAS-2B细胞TNF-α和IL-6的表达。
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关键词:
- 双氢青蒿素 /
- 甲型流感病毒H1N1 /
- ERK信号通路
Abstract:Objective To investigate the effects of dihydroartemis (DHA) on influenza A virus (IAV) A/PR/8/34 (H1N1) induces the pro-inflammatory factor and protein of extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway expression in bronchial epithelial cells.Methods The BEAS-2B cells were treated with different concentrations of DHA (i.e.,0, 12.5, 25, 50 and 100 μmol/L) for 24 h and the effect of DHA on the viability of BEAS-2B cells were measure by CCK8 method. The BEAS-2B cells were absorbed with IAV for 1 h, and then were treated with different concentrations of DHA (i.e., 12.5, 25 and 50 μmol/L) for 24 h, meanwhile, the normal control group and IAV group were established. The mRNA and protein expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin (IL-6) were measured by real time quantitative PCR (RT-qPCR) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), the expression levels of phospho-ERK (p-ERK) proteins were tested by Western blot (WB). Then, an ERK agonist (20 ng/mL) was used to treat BEAS-2B cells (the groups were divided into normal control group, DHA group, DHA+IAV group, ERK agonist group and DHA+IAV+ERK agonist group) for 24 h, and to observe the effect of DHA on inhibiting IAV induce the TNF-α, IL-6 and p-ERK expression in the BEAS-2B cells.Results The BEAS-2B cells viability was not significantly different from that of the normal control group after treatment with DHA (i.e., 12.5, 25, and 50 μmol/L). The expression levels of TNF-α, IL-6 mRNA and TNF-α, IL-6, p-ERK protein in IAV group were significantly up-regulated compared with that in the normal control group (P<0.05), meanwhile, compared with the IAV group, the expression levels of TNF-α, IL-6 mRNA and TNF-α, IL-6, p-ERK protein showed dose-dependent decrease in IAV+DHA group (P<0.05). However, ERK agonists attenuated the DHA inhibit IAV induced the proinflammatory factors TNF-α, IL-6 secretion and the p-ERK protein expression of ERK signaling pathway in BEAS-2B cells.Conclusion These data suggest that DHA can inhibit IAV induces the TNF-α and IL-6 expression in BEAS-2B cells through ERK signaling pathway.-
Keywords:
- Dihydroartemis /
- Influenza A virus H1N1 /
- ERK signaling pathway
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甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）是季节性流感的主要病原体，每年季节性流感导致29万～65万患者死亡，严重威胁人类健康[1-2]。流感病毒感染后诱导促炎症因子水平的增加，引发机体过度免疫应答，形成细胞因子风暴，导致组织病理损伤和器官衰竭是流感患者死亡的主要原因。因此，抑制流感患者促炎症因子水平，是控制细胞因子风暴的发生及降低流感患者死亡的主要策略之一[3-5]。但现阶段临床上治疗流感病毒的药物在此方面效果有限，急需探索新的药物以应对流感病毒流行。
双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是临床安全、有效的抗疟疾药物[6]，同时还具有抗肿瘤[7]，抗寨卡病毒[8]和抗炎[9-10]等生物学功能。此外DHA还可抑制细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症反应[11]。流感病毒侵入呼吸道上皮细胞后首先诱导促炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达，随后白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）水平显著升高，TNF-α和IL-6增加会进一步促进炎症反应，导致组织损伤，加重病情[12-14]。同时流感病毒感染后细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）信号通路也被显著激活，进而调控相关基因表达[15]。但DHA能否抑制IAV诱导TNF-α和IL-6表达及相关信号通路是否与ERK信号通路有关，现阶段还未见相关报道。因此，本研究通过观察DHA对甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）诱导人支气管上皮细胞（BEAS-2B）促炎症因子和ERK信号通路蛋白表达的影响，以及ERK激动剂作用于细胞后，促炎症因子和ERK信号通路蛋白表达的变化，探讨DHA的作用机制，为DHA成为抗流感病毒感染药物提供理论研究基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株
狗肾上皮细胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK）和人支气管上皮细胞（BEAS-2B）购自中国科学院昆明细胞库。
1.1.2 病毒毒株
甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心提供。SPF级鸡胚由济南斯帕法斯家禽有限公司提供。
1.1.3 主要试剂与仪器
总RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（宝日医生物技术北京有限公司）；UltraSYBR Mixture（High ROX）（北京康为世纪生物科技有限公司）；TGX Stain-FreeTM FastCastTM Acrylamide Kit（美国BIO-RAD公司）；兔抗ERK、磷酸化ERK（p-ERK）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国CST公司）；人TNF-α和IL-6 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（北京义翘神州科技有限公司）；CCK8试剂盒（东仁化学科技(上海)有限公司）；双氢青蒿素（中国索莱宝公司）；BEAS-2B细胞专用培养基（KCB）（中国科学院昆明细胞库）；DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司）；ERK激动剂（ERK agonist，美国Peprotech公司）；ECL发光液和PVDF膜（美国Millipore公司）；封闭液（上海碧云天生物技术有限公司）；GAPDH、TNF-α和IL-6基因引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
CFX96型实时荧光定量PCR仪和凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；NanoDrop 2000型紫外分光光度计（美国Thermo公司）；371型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；HFsafe-1500型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；ELX50型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；3300型成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计
根据GenBank中的GAPDH、TNF-α和IL-6序列，使用NCBI数据库中的Pick Primers功能，直接设计引物；然后选择长度在18~24个碱基，上游和下游碱基数相差不超过5个，自配对碱基数不超过5对，产物大小在100～300 bp之间，并且与其他基因无交叉反应的引物序列。引物序列见表1。
表 1 引物序列和扩增片段大小Table 1. Primer sequence and gene transcriptGene Sequence (5′−3′) Product length TNF-α F GAGAGATGGGGGAGATAAGGAGA 135 bp R TTAGCCCTGAGGTGTCTGGTT IL-6 F TGAACTCCTTCTCCACAAGCG 187 bp R CCGTCGAGGATGTACCGAAT GAPDH F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 258 bp R AGGGGCCATCCACAGTCTTC 1.2.2 病毒增殖及组织半数感染量（TCID50）测定
病毒增殖：在无菌操作台中，用注射器取病毒液0.2 mL，接种至9日龄鸡胚尿囊腔中，于37 ℃恒温箱中培养48 h，48 h后将鸡胚置于4 ℃过夜，次日抽取鸡胚尿囊液，尿囊液经0.2 μm孔径滤器过滤后备用。TICD50测定：待96孔板中MDCK细胞生长至底面积80%时，去原培养基，细胞用PBS洗涤3次。将病毒增殖液用无血清DMEM培养基（含1 μg/mL TPCK-胰酶）按10倍梯度倍比稀释（10−1～10−9），将稀释后的病毒液加入含MDCK细胞的96孔板中，每个稀释梯度重复6孔，同时设置阴性对照；然后毎孔补加150 μLDMEM培养基（含1%胎牛血清），在37 ℃，体积分数5% CO2条件下常规培养72 h。然后按常规用Reed-Muench公式计算病毒的TCID50。
1.2.3 DHA对BEAS-2B细胞活性影响
待96孔板中BEAS-2B细胞生长至底面积90%时，去原培养基，分别加入用不含血清DMEM培养基稀释的DHA溶液（12.5、25、50、100 μmol/L），同时设置空白组（无细胞）和正常对照组（不含DHA），每个组重复5孔。常规培养24 h后，加入细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8, CCK8）的试剂作用1 h，酶标仪450 nm处，以空白组孔调零，读取吸光度（A）值。计算DHA对细胞活性的影响：细胞存活率=实验组A值/正常对照组A值。
1.2.4 实验分组和DHA、ERK激动剂干预BEAS-2B细胞
①待6孔板中的细胞生长至底面积90%时，将培养细胞分为5组：正常对照组、IAV组和IAV+DHA低、中、高浓度（12.5、25、50 μmol/L）干预组。除正常对照组细胞外，各组细胞加入100×TCID50的IAV病毒吸附1 h，然后PBS洗涤3次，去除未吸附的病毒，按分组分别加入对应浓度的DHA溶液作用24 h。②待6孔板中的细胞生长至底面积90%时，将培养细胞分为6组：正常对照、IAV、DHA、DHA+IAV、ERK agonist、DHA+IAV+ERK agonist组。根据实验分组需感染IAV的组别，加入100×TCID50的IAV病毒吸附1 h，然后PBS洗涤3次，去除未吸附的病毒，按分组分别加入对应浓度的DHA（50 μmol/L）或ERK agonist（20 ng/mL）作用24 h。
1.2.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测TNF-α和IL-6 mRNA表达
按RNAsimple提取试剂盒说明书方法提取细胞总mRNA，并按PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书方法将提取的mRNA逆转录为cDNA，取1 μL cDNA用于RT-qPCR检测。扩增条件：95.0 ℃预变性10 min，95.0 ℃变性10 s、60.0 ℃退火延伸30 s、扩增40个循环。扩增结束后TNF-α和IL-6 mRNA的相对表达水平用2−ΔΔCt方法进行计算。以对照组 TNF-α 和 IL-6 mRNA的2−ΔΔCt值为1，计算其他组 TNF-α 和 IL-6 mRNA的相对表达水平。
1.2.6 ELISA检测TNF-α和IL-6蛋白水平
细胞培养上清经12 000×g，离心10 min，收集上清，按照TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒说明书进行加样检测，同时设置标准曲线及空白孔，检测结果在酶标仪450 nm处，经空白孔调零，读取A值。绘制TNF-α和IL-6标准曲线，根据标准曲线计算样本中TNF-α和IL-6蛋白水平。
1.2.7 蛋白质印迹法（Western blot）检测p-ERK蛋白的表达
采用放射性免疫沉淀测定裂解液（RIPA）提取细胞总蛋白并制备成电泳样品；样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，将凝胶上的目的蛋白分子分别转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）模上；PVDF膜TBST洗涤及封闭液封闭后，分别加入兔抗ERK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）抗体，4 ℃孵育过夜；TBST漂洗后加入HRP-羊抗兔IgG（1∶5 000），室温孵育40 min；TBST漂洗后加入ECL发光液于凝胶成像系统中采集图像，分析目的蛋白灰度值；细胞中p-ERK蛋白相对表达水平=p-ERK条带灰度值/ERK条带灰度值。
1.3 统计学方法
实验独立重复3次，结果用
$\bar x \pm s$ 表示。进行单因素方差分析和LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 DHA对BEAS-2B细胞活性影响
CCK8法检测结果（图1）显示，DHA浓度在12.5、25、50 μmol/L时，细胞存活率与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），当DHA浓度达100 μmol/L时，细胞存活率低于正常对照组（P<0.05）。取对BEAS-2B细胞活性无影响的DHA浓度12.5、25、50 μmol/L进行后续实验。
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图 1 DHA对BEAS-2B细胞活性影响（n=3）Figure 1. Effect of DHA on BEAS-2B cells viability（n=3）*P<0.05, vs. control group2.2 DHA对甲型流感病毒H1N1诱导的促炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表达的影响
RT-qPCR（图2A）和ELISA检测（图2B）结果显示，与正常对照组比较，IAV组细胞TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平增高 (P<0.05)，与IAV组比较，IAV+ DHA低、中、高浓度组细胞TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平下降 (P<0.05)，且随着DHA浓度增加，细胞TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平呈下降趋势，说明DHA可抑制甲型流感病毒H1N1诱导促炎症因子TNF-α和IL-6表达。
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图 2 各组细胞中TNF-α、IL-6 mRNA（A）和TNF-α、IL-6蛋白（B）的表达（n=3）Figure 2. The expression levels of TNF-α, IL-6 mRNA (A) and TNF-α, IL-6 protein (B) in each group cells（n=3）*P<0.05, vs. control group；#P<0.05, vs. IAV group2.3 DHA对甲型流感病毒H1N1诱导的ERK信号通路蛋白p-ERK表达的影响
Western blot检测结果（图3）显示，与正常对照组比较，IAV组p-ERK蛋白表达水平增高 (P<0.05)，与IAV组比较，IAV+ DHA低、中、高浓度组细胞p-ERK蛋白表达水平下降 (P<0.05)，且随着DHA浓度增加，细胞p-ERK蛋白表达水平呈下降趋势。说明DHA可抑制甲型流感病毒H1N1诱导ERK信号通路活化。
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图 3 各组细胞中p-ERK的表达水平（n=3）Figure 3. The expression levels of p-ERK in each group cells (n=3)*P<0.05, vs. control group；#P<0.05, vs. IAV group2.4 ERK激活剂对DHA抑制甲型流感病毒H1N1诱导的p-ERK蛋白表达的影响
Western blot检测结果（图4）显示，与正常对照组比较，DHA组的p-ERK蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），DHA+IAV+ERK agonist、ERK agonist、IAV组p-ERK蛋白表达水平增高(P<0.05)；与IAV组比较，DHA+IAV和DHA+IAV+ERK agonist组p-ERK蛋白表达水平降低（P<0.05）；与DHA+IAV+ERK agonist组比较，DHA+IAV组p-ERK蛋白表达水平降低（P<0.05）。说明ERK激活剂减弱了DHA抑制IAV诱导p-ERK蛋白的表达。
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图 4 各组细胞中p-ERK表达水平（n=3）Figure 4. The expression levels of p-ERK in each group cells（n=3）ΔP<0.05, vs. control group；*P<0.05, vs. IAV group；#P<0.05，vs. DHA+IAV+ ERK agonist group2.5 ERK激活剂对DHA抑制甲型流感病毒H1N1诱导的TNF-α和IL-6表达的影响
RT-qPCR（图5A）和ELISA检测（图5B）结果显示，与正常对照组比较，DHA组TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），DHA+IAV+ERK agonist、ERK agonist、IAV组TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平增高(P<0.05)；与IAV组比较，DHA+IAV和DHA+IAV+ERK agonist组TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）；与DHA+IAV+ERK agonist组比较，DHA+IAV组TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）。说明ERK激活剂减弱了DHA抑制IAV诱导促炎症因子TNF-α和IL-6的表达。
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图 5 各组细胞中TNF-α、IL-6 mRNA（A）和TNF-α、IL-6蛋白（B）的表达（n=3）Figure 5. The mRNA (A) and protein (B) expression levels of TNF-α and IL-6 in each group (n=3)ΔP<0.05, vs. control group；*P<0.05, vs. IAV group；#P<0.05, vs. DHA+IAV+ ERK agonist group3. 讨论
细胞因子风暴是指病原体感染、药物或疾病等引起的免疫系统过度激活，一旦发生将迅速引发器官衰竭，威胁患者生命，同时也是高致病性流感病毒[16-17]及冠状病毒[18-19]〔严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）、中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）和新型冠状病毒(SARS-CoV-2）〕等呼吸道病毒致死的主要原因，其危害性比病毒自身复制的危害更为严重。其中1918年和2009年流行的流感病毒均因诱发细胞因子风暴造成大量患者死亡[16-17]。呼吸道上皮细胞是流感病毒首先侵入的细胞，当病毒进入机体后首先诱导呼吸道上皮细胞促炎症因子分泌，促炎症因子可使炎症细胞活化、迁移，进一步加重感染部位炎症反应，进而引发细胞因子风暴，导致组织病理损伤或器官衰竭等并发症，加重患者病情或使患者死亡[4]。因此在流感病毒感染后抑制促炎症因子分泌，可在一定程度上控制细胞因子风暴的发生，进而降低患者死亡人数。
流感病毒感染呼吸道上皮细胞后首先诱导促炎症因子TNF-α分泌，随之 IL-6的分泌也显著增加[12]，TNF-α分泌后可诱导白细胞迁移，肺内皮细胞活化和粒细胞脱颗粒；此外IL-6促进巨噬细胞和中心粒细胞的增殖，导致更多炎症因子分泌，加重感染部位炎症反应[13-14]。在细胞因子风暴中TNF-α和IL-6被认为是关键节点，针对TNF-α和IL-6的治疗被认为是治疗重症流感患者的可行方法[20-21]。DAI等[5]研究发现氧化苦参碱可抑制小鼠感染IAV后肺组织损伤和降低小鼠的死亡率，进一步研究发现氧化苦参碱是通过抑制肺组织中促炎症因子TNF-α和IL-6等炎症因子表达，进而保护小鼠肺组织免受损伤。同样姜黄素减轻流感病毒导致小鼠的肺组织损伤，也与其抑制促炎症因子表达相关[22]。本研究结果发现，IAV感染BEAS-2B细胞后诱导TNF-α和IL-6表达，而DHA以剂量依赖性下调IAV诱导TNF-α和IL-6表达，证实DHA具有抑制流感病毒诱导呼吸道上皮细胞促炎症因子TNF-α和IL-6分泌的作用。流感病毒感染后可通过不同机制活化ERK信号通路，进而促进病毒的复制和增加炎症因子表达[15, 23-24]。SCHRÄDER等[25]研究显示，采用ERK信号通路抑制剂不仅抑制了流感病毒复制，还抑制了流感病毒诱导的促炎症因子和趋化因子表达。本实验结果显示，IAV感染BEAS-2B细胞后ERK信号通路蛋白p-ERK表达增加，说明ERK信号通路活化，而DHA可剂量依赖性抑制IAV诱导的p-ERK表达，抑制ERK信号通路活化；而给予ERK激动剂后减弱了DHA抑制IAV诱导BEAS-2B细胞ERK信号通路蛋白p-ERK表达和促炎症因子TNF-α和IL-6的分泌。
综上所述，在本研究中我们将已在临床上使用安全的药物DHA用于抗IAV感染及作用机制研究，证实DHA可以抑制IAV诱导BEAS-2B细胞ERK信号通路蛋白p-ERK表达和促炎症因子TNF-α、IL-6的分泌。同时我们进一步采用ERK激动剂进行反向论证，发现DHA作用机制是通过抑制IAV诱导ERK信号通路的活化，从而抑制促炎症因子TNF-α和IL-6表达，证实了DHA抑制IAV感染炎症反应的部分作用机制和调控靶点。但本研究仅在体外探索了DHA在流感病毒感染后的抗炎作用，无法观察到DHA对流感病毒导致的肺损伤保护效果；同时流感病毒感染后炎症因子的分泌不仅受ERK信号通路的调控，这是本研究存在的不足。因此在今后研究中我们将进一步观察DHA体内抗流感的效果，并采用转录组学更全面的研究DHA在流感病毒感染后抗炎的分子机制。虽然本研究存在上述不足，但首次阐明了DHA可通过ERK信号通路抑制IAV诱导BEAS-2B细胞TNF-α和IL-6的表达，为DHA成为抗流感病毒感染药物和进一步的研究提供了理论研究基础。
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图 1 DHA对BEAS-2B细胞活性影响（n=3）
Figure 1. Effect of DHA on BEAS-2B cells viability（n=3）
*P<0.05, vs. control group
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图 2 各组细胞中TNF-α、IL-6 mRNA（A）和TNF-α、IL-6蛋白（B）的表达（n=3）
Figure 2. The expression levels of TNF-α, IL-6 mRNA (A) and TNF-α, IL-6 protein (B) in each group cells（n=3）
*P<0.05, vs. control group；#P<0.05, vs. IAV group
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图 3 各组细胞中p-ERK的表达水平（n=3）
Figure 3. The expression levels of p-ERK in each group cells (n=3)
*P<0.05, vs. control group；#P<0.05, vs. IAV group
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图 4 各组细胞中p-ERK表达水平（n=3）
Figure 4. The expression levels of p-ERK in each group cells（n=3）
ΔP<0.05, vs. control group；*P<0.05, vs. IAV group；#P<0.05，vs. DHA+IAV+ ERK agonist group
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图 5 各组细胞中TNF-α、IL-6 mRNA（A）和TNF-α、IL-6蛋白（B）的表达（n=3）
Figure 5. The mRNA (A) and protein (B) expression levels of TNF-α and IL-6 in each group (n=3)
ΔP<0.05, vs. control group；*P<0.05, vs. IAV group；#P<0.05, vs. DHA+IAV+ ERK agonist group
表 1 引物序列和扩增片段大小
Table 1 Primer sequence and gene transcript
Gene Sequence (5′−3′) Product length TNF-α F GAGAGATGGGGGAGATAAGGAGA 135 bp R TTAGCCCTGAGGTGTCTGGTT IL-6 F TGAACTCCTTCTCCACAAGCG 187 bp R CCGTCGAGGATGTACCGAAT GAPDH F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 258 bp R AGGGGCCATCCACAGTCTTC 
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