欢迎来到《四川大学学报(医学版)》 2025年4月4日 星期五

基于流式细胞术的大鼠骨髓网织红细胞微核实验方法的建立

曾珠, 朱雪娇, 霍娇, 刘运杰, 彭子豪, 陈锦瑶, 张立实

曾珠, 朱雪娇, 霍娇, 等. 基于流式细胞术的大鼠骨髓网织红细胞微核实验方法的建立[J]. 四川大学学报(医学版), 2020, 51(1): 67-73. DOI: 10.12182/20200160603
引用本文: 曾珠, 朱雪娇, 霍娇, 等. 基于流式细胞术的大鼠骨髓网织红细胞微核实验方法的建立[J]. 四川大学学报(医学版), 2020, 51(1): 67-73. DOI: 10.12182/20200160603
ZENG Zhu, ZHU Xue-jiao, HUO Jiao, et al. The Establishment of a Three-color Flow Cytometry Approach for the Scoring of Micronucleated Reticulocytes in Rat Bone Marrow[J]. Journal of Sichuan University (Medical Sciences), 2020, 51(1): 67-73. DOI: 10.12182/20200160603
Citation: ZENG Zhu, ZHU Xue-jiao, HUO Jiao, et al. The Establishment of a Three-color Flow Cytometry Approach for the Scoring of Micronucleated Reticulocytes in Rat Bone Marrow[J]. Journal of Sichuan University (Medical Sciences), 2020, 51(1): 67-73. DOI: 10.12182/20200160603

栏目: 技术与方法

基于流式细胞术的大鼠骨髓网织红细胞微核实验方法的建立

基金项目: 国家自然科学基金面上项目(No. 8157120809)、国家自然科学基金青年科学基金(No. 81703258)、四川大学创新火花项目(No. 2018SCUH0005)和四川省科学技术厅应用基础项目(No. 2019YJ0020)资助
详细信息
    通讯作者:

    张立实: E-mail:lishizhang_56@163.com

The Establishment of a Three-color Flow Cytometry Approach for the Scoring of Micronucleated Reticulocytes in Rat Bone Marrow

  • 摘要:
      目的  建立并验证大鼠骨髓网织红细胞(reticulocytes,RETs)微核的流式细胞术检测方法。
      方法  选用CD71-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记骨髓网织红细胞,CD45-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记白细胞,核酸染料DRAQ5标记DNA,建立骨髓微核的流式细胞术检测方法。SD大鼠随机分为甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)、N-乙基-N-亚硝基脲(ethyl nitrosourea,ENU)和秋水仙素(colchicine,COL)染毒组,各组大鼠按染毒剂量不同再分为4亚组,每亚组5只。以染毒剂量为0,作为各组溶剂对照。染毒方案为间隔24 h两次经口给药。末次给药后24 h采集双侧股骨骨髓,采用本研究建立的基于流式细胞术的骨髓微核检测方法测定骨髓中的RETs微核率和RETs比例,并同时使用人工显微镜下计数方法进行检测。
      结果  成功建立基于流式细胞术的骨髓微核检测方法。采用该方法检测20只溶剂对照大鼠骨髓微核率(背景微核率)为0.83‰±0.12‰,采用人工显微镜下计数微核的方法检测的溶剂对照大鼠背景微核率为1.43‰±0.44‰,基于流式细胞术计数骨髓微核的方法背景微核率更低,且更为稳定。两种方法均可检测到EMS、CP、ENU、COL染毒后RETs微核率呈染毒剂量依赖性上升趋势,RETs比例呈染毒剂量依赖性下降。两种方法检测4种受试物诱导的RETs微核率相关性良好(相关系数为0.834 3~0.913 7)。
      结论  本实验建立的基于流式细胞术的骨髓微核检测方法具有操作简便、灵敏快捷、背景微核率较低等优势,是人工微核计数方法的良好替代,可应用于化学物的遗传毒性评价。

     

    Abstract:
      Objective  To develop and verify a flow cytometric measurement of reticulocytes (RETs) micronucleus in rat bone marrow.
      Methods  In our flow cytometric protocol, reticulocytes, leukocytes and DNA were labeled by anti-CD71-fluorescein isothiocyanate (FITC), anti-CD45-phycoerythrin (PE) and DRAQ5, respectively. Sprague-Dawley (SD) rats were assigned to four treatment groups randomly, and were exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), cyclophosphamide (CP), ethyl nitrosourea (ENU) and colchicine (COL) respectively. Each treatment group was divided into four subgroups (5 rats per subgroup) according to different exposure dosage. A exposure dose of 0 was used as vehicle control for each group. Rats were administered with testing mutagens by gavage twice with a 24 h interval. Bone marrow from both femurs were collected 24 h after the last administration. The frequency of micronucleated reticulocytes (MN-RETs) and the percentage of reticulocytes (RETs%) were determined by flow cytometric measurement established in this study. And the manual counting method with microscope (by Giemsa staining) was conducted at the same time.
      Results  A method for detection of reticulocyte micronucleus in bone marrow based on flow cytometry was successfully established. The MN-RETs in rat bone marrow of 20 SD rats treated by vehicle (i.e., background value of MN-RETs) was 0.83‰±0.12‰ by this method. The background value of MN-RETs in manual enumeration method was 1.43‰±0.44‰. It was obvious that the flow cytometric method had lower background value and more stable results. The trend, in which MN-RETs ascended and RETs% descended with increasing dose, can be detected by both methods in rats that exposed to EMS, CP, ENU and COL. Both methods were good to detect the correlation of induced-MN-RETs with four testing mutagens (the correlation coefficients were ranged from 0.834 3 to 0.913 7).
      Conclusion  With its sensitivity, rapidity, easy operation and low background value, the three-color flow cytometric enumerative protocol established in our laboratory can be used as a good substitute for manual micronucleus counting method and used in genotoxicity assessment of chemical substances.

     

  • 微核实验可检测染色体断裂或有丝分裂器损伤,具有方法简便、易于操作、终点明确、结果稳定、重复性好等优点,是一种应用广泛的遗传毒性实验方法。体内微核实验主要用于筛选染色体断裂剂或非整倍体诱导剂,是国际人用药品注册技术协调会(ICH)、美国食品药品监督管理局(FDA)、我国卫生健康委员会等国际组织和国家管理部门推荐的首选体内遗传毒性实验之一[1-3]。传统微核检测方法通常采用染色后显微镜下人工计数获得结果,随着流式细胞术、激光扫描细胞仪和成像流式细胞术等自动化检测方法的引入,极大地改善了传统微核计数方法耗时耗力、受主观因素影响较大等缺点,其中流式细胞术更加高效、快捷、操作简便,具有广泛的应用前景。

    目前使用的骨髓细胞流式微核实验方法主要有4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)单染、Hoechst 33342/噻唑橙双染、CD71-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/CD61-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)三染等,但由于无法区分网织红细胞(reticulocytes,RETs),操作复杂,且需要使用配备紫外光的流式细胞仪等因素,其推广与应用受到了一定限制[4-5]。本研究采用CD71-FITC标记RETs,CD45-PE标记白细胞,核酸染料DRAQ5标记DNA,建立一种基于三色流式细胞术分析方法的骨髓微核检测技术,克服了上述方法的缺陷,并应用建立的该方法对甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)、N-乙基-N-亚硝基脲(ethyl nitrosourea,ENU)和秋水仙素(colchicine,COL)4种典型阳性诱变剂[6]诱导大鼠产生的骨髓RETs微核进行检测,同时与传统人工计数方法进行对比,现将结果报道如下。

    EMS〔美国化学文摘服务社(CAS)登录号:62-50-0〕、CP(CAS号:6055-19-2)、ENU(CAS号:759-73-9)、COL(CAS号:64-86-8)购自Sigma-Aldrich;FITC anti-rat-CD71购自BD Biosciences;anti-rat-CD45-PE和DRAQ5购自Abcam;PBS(pH7.4)购自Hyclone;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自上海复蒙基因生物科技有限公司;Giemsa购自Sigma-Aldrich。

    具有488 nm和633 nm激光器的FACS Verse型流式细胞仪(美国,BD Biosciences)。

    6~7周龄SPF级雄性SD大鼠80只,购于成都达硕实验动物有限公司,许可证号:SCXK(川)2015-030,饲养于四川大学华西公共卫生学院实验动物中心独立通风笼盒(IVC)屏障系统,动物房使用合格证号:SYXK(川)2018-011。室温20~23 ℃,相对湿度60%~65%,昼夜周期为12 h。实验操作开始前适应性喂养至少1周。在整个实验过程中,保证自由摄取食物和饮水。

    大鼠随机分为EMS、CP、ENU、COL染毒组,每组20只。各组按染毒剂量不同再分为4亚组,每亚组5只。各亚组染毒剂量分别为EMS 0、50、100、200 mg/kg;CP 0、5、10、15 mg/kg;ENU 0、20、40、80 mg/kg;COL 0、4、6、8 mg/kg。各组中染毒剂量0 mg/kg为溶剂对照,其中EMS、CP、COL溶剂对照为纯水,ENU溶剂对照为PBS(pH=6.0)。染毒方案为间隔24 h两次经口给药,灌胃体积为10 mL/kg。

    在末次给药后24 h,处死实验动物,暴露并取出双侧股骨,清除附着组织。使用注射器吸取FBS,反复冲洗骨髓腔采集骨髓,置于4 ℃避光保存待检。

    采用CD71- FITC标记骨髓RETs,CD45-PE标记白细胞,核酸染料DRAQ5标记DNA,建立基于流式细胞术的骨髓微核检测方案。具体为将收集的骨髓细胞以300×g离心5 min后,弃上清,加入50 μL PBS重悬。取20 μL骨髓细胞混悬液加入到100 μL染色体系中(含2 μg CD71-FITC、2 μg CD45-PE和2 μL FBS),混匀后置于4 ℃避光染色30 min。将完成表面抗原染色的骨髓细胞转移至含 有5 mL PBS的离心管中清洗,300×g离心5 min。弃上清,去除游离抗体,将下层细胞重悬于1 mL DRAQ5应用液(20 μmol/L),混匀后置于37 ℃避光染色30 min。再加入 5 mL PBS清洗后离心(300×g,5 min),弃上清,加入1 250 μL PBS重悬并转移至流式细胞管。于4 ℃避光保存,4 h内完成流式检测。

    使用前向角散射(forward scatter,FSC)、侧向角散射(side scatter,SSC)、FITC、PE、APC通道获取信号参数,使用BD Biosciences公司软件BD FACSuite Software Bundle v1.0进行分析。

    分析指标为RETs微核率和RETs比例,每样本至少检测20 000个RETs。DRAQ5+/FITC+为含有微核的RETs,DRAQ5/FITC为成熟红细胞(red blood cells,RBCs),DRAQ5/FITC+为RETs。具体计算公式如下:

    $$ { \begin{aligned} &{{\rm{RETs}}{\text{微核率}}\left( {\text ‰} \right) = \frac{{{\rm{P}}8}}{{{\rm{P}}7 + {\rm{P}}8}} \times 1\,000}\\ &{{\rm{RETs}}{\text{比例}}\left( {\text \%} \right) = \frac{{{\rm{P}}7 + {\rm{P}}8}}{{{\rm{P}}5 + {\rm{P}}6 + {\rm{P}}7 + {\rm{P}}8}} \times 100} \end{aligned}} $$

    式中P5为RBCs,P6为RBCs微核,P7为RETs,P8为RETs微核。

    采用常规骨髓涂片与Giemsa染色,显微镜下计数微核。每只动物骨髓制作3张平行涂片,晾干后即使用甲醇固定5 min,自然风干后置于阴凉干燥处保存。观察前用Giemsa染色5 min,用纯水轻缓冲去多余染料,置于油镜下阅片。每只动物计数4 000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes,PCEs)中含微核PCEs的数量,以及2 000个红细胞中PCEs与正染红细胞(normochromatic erythrocyte,NCEs)的数量。

    计量数据均以$\bar x \pm s$表示。使用Kruskal-Wallis H秩和检验对RETs微核率进行统计分析,差异有统计学意义时使用Wilcoxon秩和检验比较各剂量组与对照组之间的差异(检验水准α单侧=0.05)。使用单因素方差分析对RETs比例进行检验,差异有统计学意义时使用Dunnett-t检验比较各剂量组与对照组之间的差异 (检验水准 α双侧=0.05)。使用Jonckheere-Terpstra检验对各剂量组的趋势性进行分析。采用Pearson相关分析比较流式微核计数和人工微核计数结果。

    通过FSC和SSC排除大部分的血小板、细胞碎片和粘连,确定单个细胞群(包括红细胞和白细胞),见图1A1B;使用PE通道排除CD45荧光信号较强的细胞群,即排除白细胞的干扰(图1C);使用检测微核的核酸染料DRAQ5(APC通道)信号设门排除有核细胞和噪音干扰(图1D);借助特异性识别RETs的抗体CD71(FITC通道)和APC通道识别不同的细胞群(图1E1F)。

    图  1  骨髓细胞流式微核实验设门过程及结果
    Figure  1.  Gating strategy and results for flow cytometric measurement of reticulocyte micronucleus in rat bone marrow
    A-F: Gating strategy; E: Negative result; F: Positive result. P1-P2: Red blood cell (RBCs), RETs and leukocytes; P3: RBCs and RETs; P4: RBCs and RETs without karyocytes; P5: Red blood cell (RBCs); P6: MN-RBCs; P7: RETs; P8: MN-RETs

    采用本研究建立的基于流式细胞术计数骨髓微核的方法,检测20只溶剂对照大鼠(每组5只)骨髓微核,结果显示,骨髓RETs背景微核率为0.83‰±0.12‰,百分位数P25、P50、P75分别为0.73‰、0.80‰、0.98‰。采用人工显微镜下计数微核的方法,计数20只溶剂对照大鼠骨髓微核,背景微核率为1.43‰±0.44‰,P25、P50、P75分别为1.25‰、1.50‰、1.76‰。可见基于流式细胞术计数骨髓微核的方法背景微核率更低,且更为稳定。

    EMS染毒后采用流式细胞术计数与人工显微镜下计数方法观察到RETs微核率随染毒剂量的变化趋势一致(图2A)。RETs微核率均呈染毒剂量依赖性上升趋势(P<0.05),流式细胞术计数方法观察到在50、100、200 mg/kg EMS染毒组RETs微核率较溶剂对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05),而人工显微镜下计数仅在100和200 mg/kg EMS染毒组RETs微核率的升高差异有统计学意义(P<0.05)。两种分析方法均可观察到各剂量组RETs比例呈剂量依赖性下降(P<0.05)。

    图  2  EMS、CP、ENU和COL流式细胞术分析方法和人工计数的微核结果
    Figure  2.  Flow cytometric and manual enumeration of micronucleus induced by EMS, CP, ENU and COL
    FCM: Flow cytometric measurement; Manual: Manual measurement; MN-RETs‰: Permillage of MN-RETs; RETs%: Percentage of RETs; *P<0.05,vs. control group

    CP染毒后,流式细胞术计数和人工显微镜下计数方法RETs微核率均呈染毒剂量依赖性增加(P<0.01,图2B)。流式细胞术计数在5、10、15 mg/kg CP染毒组RETs微核率较溶剂对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05),而人工计数仅在10和15 mg/kg CP染毒组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。两种分析方法均可观察到各剂量组RETs比例呈剂量依赖性减少(P<0.05)。

    ENU染毒后,流式细胞术计数和人工显微镜下计数方法RETs微核率呈现染毒剂量依赖性的增加(P<0.01),RETs比例呈现剂量依赖性减少(P<0.01),见图2C。流式细胞术计数在20、40和80 mg/kg ENU染毒组RETs微核率较溶剂对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05),而人工显微镜下计数方法仅在最高2个ENU染毒剂量组(40和80 mg/kg)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

    COL染毒后,两种分析方法均可观察到RETs微核率呈现剂量依赖性增加(P<0.01),RETs比例呈现剂量依赖性的降低(P<0.01),见图2D。流式细胞术分析方法在4、6和8 mg/kg COL染毒组RETs微核率较溶剂对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05),而人工显微镜下计数方法仅在最高ENU染毒剂量组(8 mg/kg)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

    两种方法检测4种阳性诱变剂作用后的RETs微核率与RETs比例均具有良好的相关性(图3图4)。对于EMS、CP、ENU和COL,两种方法RETs微核率的相关系数分别为0.834 3、0.892 8、0.913 7、0.836 0(P均<0.01);RETs比例的相关系数分别为0.973 3、0.923 5、0.970 6、0.926 5(P均<0.01)。

    图  3  流式细胞术分析和人工计数法分析EMS(A)、CP(B)、ENU(C)和COL(D)染毒组微核率的相关性
    Figure  3.  Relevance of MN-RETs‰ between flow cytometric and manual counting methods induced by EMS (A), CP (B), ENU (C) and COL (D)
    图  4  流式细胞术分析方法和人工计数法分析EMS(A)、CP(B)、ENU(C)和COL(D)染毒组RETs比例的相关性
    Figure  4.  Relevance of RETs% between flow cytometric and manual counting methods induced by EMS (A), CP (B), ENU (C) and COL (D)

    传统微核实验采用人工显微镜下计数的方法,该方法费时费力,且受主观因素影响较大,越来越难以满足实际需求,自动化仪器检测方法应运而生。流式细胞术的引入带来了更高的分析效力和灵敏度、更低的变异度,且具有客观、快速的优势,同时还加速了微核实验与一般毒性实验的整合,对于“3R”原则(减少、替代、优化)和动物福利而言有重要意义[7-8],具有广泛的应用前景。基于流式细胞术的微核实验可选用外周血或骨髓组织作为检测对象。将外周血细胞作为检测对象可在不处死动物的情况下实现目标细胞的反复收集,且红细胞均质性好、信号受干扰程度小[9];而骨髓细胞自发率低、稳定性好,在相同的诱导条件下骨髓中RETs微核的发生频率高于外周血,且对于大鼠等脾脏具有微核清除作用的物种而言检测灵敏度更高[10]。因此,使用骨髓细胞进行的微核实验目前在遗传毒性评价实验中仍具有重要地位。1982年,HUTTER等[11]使用DAPI和磺基罗丹明101(sulforhodamine 101,SR 101)双染检测了小鼠骨髓红细胞微核,发现流式细胞术分析方法检测结果与人工显微镜计数结果之间具有良好的相关性,但该方法尚不能区分RETs和RBCs,且受有核细胞的影响较大。1992年,GRAWÉ等[12]应用RNA特异荧光染料(噻唑橙)和DNA特异荧光染料(Hoechst33342)对RETs和RBCs进行了成功区分,然而由于该技术要求使用带紫外光的双激光流式细胞仪,在一定程度上限制其推广应用。1998年,CRISWELL等[13]使用吖啶橙(acridine orange,AO)染色检测了大鼠骨髓中含有微核的PCEs,虽然该方法更加经济、方便,但由于单一染料对DNA和RNA区分度有限,故该方法重复性欠佳[14]。一种以PI、抗CD71- FITC染色和RNA酶处理相结合的染色技术于2004年得到改良,增加抗血小板免疫球蛋白染色而提高了检测稳定性和灵敏度[9, 15]。然而该方法操作步骤较为繁琐,细胞破膜处理后影响设门时目标细胞的划定,且实验方法成本较高,在一定程度上限制了这一方法的推广应用。本实验室建立的基于流式细胞术的骨髓微核实验方法,首次采用CD71-FITC/CD45-PE/DRAQ5全新的荧光组合方案,只需配备双激光流式细胞仪,操作简便、无需细胞破膜处理、无需进行荧光补偿调节,成功克服了上述方法的缺陷,应用前景可观。

    本次研究选用欧洲替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods,ECVAM)发表的《遗传毒性试验验证推荐物质列表》中的4种阳性物质[6]。该4种物质具有不同的遗传毒性作用机制,分别为EMS/ENU(烷化剂)、CP(染色体断裂剂)和COL(非整倍体诱导剂),且均为遗传毒性试验常用阳性造模物质。本次研究结果与相关研究结果一致[16-18]。使用本研究中建立的流式细胞术分析方法在较低剂量可观察到4种阳性物质诱导的微核率升高,而人工计数方法由于背景水平较高、稳定性较差等原因往往难以在较低剂量组观察到微核率升高。表明本研究中建立的流式细胞术分析方法对不同遗传毒性作用模式的物质均有优良的检出能力,灵敏度较人工计数方法高。此外,本研究中的流式细胞术分析方法检测结果与传统人工微核计数方法结果具有良好的相关性。综上,可认为本实验室建立的CD71-FITC/CD45-PE/DRAQ5微核三染方案具有操作简便、灵敏高效、结果稳定、背景微核率低的特点,有较好的应用前景。

    流式微核检测方案的优势集中体现在以下几个方面:①快速、灵敏、高通量;②可得到微核大小和分布的信息;③使高效、客观地研究剂量-反应关系和毒性阈值成为可能;④有利于微核实验与常规毒理学研究的整合。但微核的流式细胞术检测也有一定的局限性,例如:流式细胞仪与荧光染料价格高昂;散落在细胞质中的凋亡小体等可能被误判为微核[19];细胞群分界不一定十分明显,应用流式细胞仪界定细胞群的阈值带有一定主观性等。流式微核实验尚处于发展阶段,缺乏得到广泛认可的实验操作程序和方法[20],各方案均需要进行进一步的验证和优化,提升其灵敏度和特异度,促进流式微核实验的标准化发展。

  • 图  1   骨髓细胞流式微核实验设门过程及结果

    Figure  1.   Gating strategy and results for flow cytometric measurement of reticulocyte micronucleus in rat bone marrow

    A-F: Gating strategy; E: Negative result; F: Positive result. P1-P2: Red blood cell (RBCs), RETs and leukocytes; P3: RBCs and RETs; P4: RBCs and RETs without karyocytes; P5: Red blood cell (RBCs); P6: MN-RBCs; P7: RETs; P8: MN-RETs

    图  2   EMS、CP、ENU和COL流式细胞术分析方法和人工计数的微核结果

    Figure  2.   Flow cytometric and manual enumeration of micronucleus induced by EMS, CP, ENU and COL

    FCM: Flow cytometric measurement; Manual: Manual measurement; MN-RETs‰: Permillage of MN-RETs; RETs%: Percentage of RETs; *P<0.05,vs. control group

    图  3   流式细胞术分析和人工计数法分析EMS(A)、CP(B)、ENU(C)和COL(D)染毒组微核率的相关性

    Figure  3.   Relevance of MN-RETs‰ between flow cytometric and manual counting methods induced by EMS (A), CP (B), ENU (C) and COL (D)

    图  4   流式细胞术分析方法和人工计数法分析EMS(A)、CP(B)、ENU(C)和COL(D)染毒组RETs比例的相关性

    Figure  4.   Relevance of RETs% between flow cytometric and manual counting methods induced by EMS (A), CP (B), ENU (C) and COL (D)

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    其他类型引用(5)

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-18
  • 修回日期:  2019-08-10
  • 网络出版日期:  2020-01-14
  • 发布日期:  2020-01-19

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