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摘要:目的 探究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)定位至线粒体的现象及其生理、病理意义。方法 ① 低氧(1%O2)或脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)、氯化钴(CoCl2)模拟低氧处理人宫颈癌细胞系HeLa和人肾癌细胞系ACHN后，蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光(IF)检测HIF-3α在细胞中的分布及其在线粒体中的表达；②通过酶敏感实验观察HIF-3α的线粒体亚结构定位；③采用Western blot检测HIF-3α在正常小鼠不同器官组织、人肝癌组织线粒体中的表达情况。结果 ① 在检测的2种细胞系(HeLa和ACHN细胞)中，HIF-3α在常氧及缺氧条件下均可定位至线粒体，且缺氧组HIF-3α在线粒体中的表达高于常氧组；②HIF-3α的消化模式与线粒体外膜蛋白一致；③HIF-3α在小鼠多种器官组织中均可定位线粒体，HIF-3α在人肝癌组织线粒体中的表达高于正常及癌旁组织。结论HIF-3α在常氧及缺氧条件下均可定位至线粒体外膜，低氧可促进其线粒体定位；该现象可能与肝癌的发生发展相关。Abstract:Objective To investigate the mitochondrial translocation of hypoxia inducible factor-3α (HIF-3α) under normoxia and hypoxia and its physiological and pathological meanings.Methods ① After hypoxic (1%O2) or DMOG, CoCl2 treatments mimicking the hypoxic treatment, Western blot and immunofluorescence were used to examine the HIF-3α expression in mitochondria of HeLa and ACHN cells, respectively. ②The protease sensitivity experiment was used to explore the sub-organelle localization of HIF-3α in mitochondria. ③Western blot was used to examine mitochondrial HIF-3α in the normal mouse tissues and human liver carcinoma tissues.Results ① In HeLa and ACHN cells, HIF-3α translocated to mitochondria under normoxia and hypoxia, and its mitochondrial expression was higher under hypoxia; ②The protease sensitivity of HIF-3α was similar to proteins locating in the mitochondrial outer membrane; ③Mitochondrial HIF-3α expressed in multiple normal mouse tissues; The expression of mitochondrial HIF-3α was higher in human liver carcinoma tissues than the normal and adjacent tissues.Conclusion HIF-3α translocated to mitochondrial outer membrane under both normoxia and hypoxia, and hypoxia could up-regulated HIF-3α mitochondrial translocation. Meanwhile, the phenomenon may be involved in the process of liver carcinoma.
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Keywords:
- HIF-3α /
- Mitochondria /
- Hypoxia /
- Normoxia
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低氧是常见的生理和病理现象，而低氧诱导因子(hypoxia inducible factors, HIFs)作为一类重要的转录因子，在机体及细胞适应低氧环境过程中发挥重要作用。实质肿瘤的浸润与迁移均伴随着低氧条件，因此肿瘤细胞本身存在低氧适应反应。
研究表明：HIFs在许多癌症中表达，并可调控血管生成、细胞存活、代谢等过程[1]。HIFs是由氧依赖型的α亚基以及组成型表达的β亚基〔又称芳香烃受体核转运蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)〕组成的异质二聚体。目前已知α亚基有3种：HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α。前2种α亚基研究较多，对HIF-3α的研究较少。且与前2种不同的是HIF-3α有多种剪切体，如：老鼠中包括全长的鼠HIF-3α(mHIF-3α)，抑制性PAS结构域蛋白(inhibitory PAS domain protein, IPAS)，新生儿和胚胎PAS蛋白(neonatal and embryonic PAS protein, NEPAS)[2-4]，人体中的剪切体有hHIF-3α 1~10[5-9]。其中，HIF-3α1通过与HIF-1/2α竞争性结合到HIF-1β，从而抑制HIF-1α和HIF-2α调控的靶基因表达，且可抑制HIF-1/2α的表达水平[5]。HIF-3α4可与HIF-1/2α和HIF-1β结合，从而抑制HIF-1/2α调控的靶基因的转录活化[8-9]。HIF-3α9可上调低氧相关靶基因如LC3C、REDD1、SQRDL等的表达[10]。在人Hep3B细胞中，HIF-3α2、HIF-3α7或HIF-3α8与HIF-1β共表达可上调低氧反应基因如促红细胞生成素(EPO)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)等基因的mRNA水平[6]。因此，在调控内源性基因表达时，不同的HIF-3α剪切体具有不同的功能。
线粒体不仅是能量供给的重要细胞器，还参与细胞中多个低氧相关反应。SNYDER等[11]综述了在低氧条件下，线粒体可调控细胞死亡或通过活化相关基因如HIFs来促进细胞存活。已有研究发现：线粒体活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)可稳定HIF-3α表达[12]。且IPAS可定位至线粒体[13]。XUE等[14]发现，HIF-3α1在直肠癌来源细胞中过表达并定位至胞质，并通过活化酪氨酸激酶(JAK)-信号转导和转录活化因子3(STAT3)通路(JAK-STAT3)促进直肠癌细胞生长。TANAKA等[15]也通过免疫荧光检测到HIF-3α蛋白常氧下定位至细胞核和胞质。本课题组前期研究发现，低氧条件下，另一种α亚基HIF-1α可转运至线粒体并定位至线粒体外膜，调控线粒体功能，最终对细胞凋亡起到一定的拮抗作用[16]。因此我们推测HIF-3α在细胞质中的定位可能是线粒体。为探讨HIF-3α是否可定位线粒体，本研究通过提纯线粒体蛋白等方法分析HIF-3α在线粒体中的表达及可能的临床意义。为区分定位在细胞核和细胞质的HIF-3α，将定位至线粒体的HIF-3α用mtHIF-3α表示。
1. 材料和方法
1.1 动物、细胞系和主要试剂
雄性C57小鼠(8~12周龄)6只，购于四川达硕公司。人正常肝癌组织、癌旁以及癌组织来自于四川大学华西医院肿瘤组织样本库。人宫颈癌细胞系(HeLa)购于中科院上海细胞库；人肾癌细胞系(ACHN)购于ATCC；MEM培养基、RMPI-1640培养基(Gibico公司)；10%胎牛血清(Biological Industries)；氯化钴(CoCl2，科龙)；脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)、蛋白酶K(Sigma-Aldrich)；Triton(Amresco)；线粒体分离试剂盒、蛋白提取试剂(Thermo Fisher)；蛋白酶抑制剂(Roche)；所有蛋白免疫印迹的设备和试剂均购于Bio-Rad公司；所用抗体分别为：HIF-3α(Novus)；增殖细胞核抗原(PCNA)(Santa)；线粒体外膜转位酶70A(TOMM70A)、线粒体外膜转位酶34(TOMM34)、线粒体内膜转位酶17A(TIMM17A)均购于Abclonal公司；组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)、葡萄糖调节蛋白75(Grp75)、线粒体ATP合酶β亚基(ATPB)、线粒体外膜转位酶40(TOMM40)、细胞色素C(Cyt-C)、凋亡调节蛋白Bcl-XL、山羊抗小鼠IgG(H+L)(DyLight® 550)、驴抗兔IgG(H+L)(Alexa FluorTM 488)均购于Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-微管蛋白(β-tubulin)、山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP、山羊抗兔IgG(H+L)-HRP均购于康为世纪。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
HeLa细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基，ACHN细胞用含10%胎牛血清的RMPI-1640培养基，并在常氧(21%O2)或缺氧(1%O2)条件下置于37 ℃培养。CoCl2(终浓度0.1 mmol/L)和DMOG(终浓度0.5 mmol/L)处理则是将试剂按终浓度加入到相应培养基。
1.2.2 分离细胞组分
按照线粒体提取试剂盒说明书操作，提取细胞完整线粒体；加入裂解液后超声破碎获得线粒体蛋白；收集细胞加入蛋白提取试剂后通过超声破碎仪(宁波新芝)提取全蛋白。
1.2.3 Western blot检测HeLa细胞常氧、缺氧下HIF-3α在线粒体中的表达
采用Western blot检测HeLa细胞在常氧(0 h)及缺氧(4 h、8 h、16 h、24 h)下HIF-3α在线粒体中的表达情况。取生长良好的HeLa细胞接种于T75培养瓶。当细胞密度达到90%~100%，按1.2.1条件常氧及缺氧处理细胞，按1.2.2方法分离获取细胞全蛋白和线粒体蛋白。蛋白样品通过恒压80 Ⅴ电泳分开后，通过恒流300 mA，2 h将蛋白条带转移到活化的PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭蛋白条带，然后分别孵育一抗和相应二抗(抗体滴度参照说明书)，采用化学发光法通过显色液进行蛋白条带显色，用凝胶成像仪拍照并测定各显色条带的灰度值。线粒体HIF-3α的相对表达以TOMM34为内参照，细胞全蛋白中细胞质HIF-3α的相对表达以GAPDH为内参照，细胞核HIF-3α的相对表达以PCNA为内参照，以HIF-3α/内参照灰度值的比值为HIF-3α蛋白的相对表达量。
1.2.4 Western blot检测CoCl2和DMOG模拟缺氧对HIF-3α在线粒体中表达的影响
同1.2.3取生长良好的HeLa细胞接种于T75培养瓶，当细胞密度达到90%~100%，按1.2.1用CoCl2和DMOG模拟缺氧条件处理细胞。前者的二价钴离子可置换脯氨酸羟化酶(PHD)辅助因子二价铁离子，阻止HIF-α被羟基化，并影响PHD与HIF-α的氧依赖型降解域(ODD)域结合，从而促进HIF-α的稳定[17]；后者可抑制PHD的活性从而稳定HIF-α的表达[18]。CoCl2和DMOG处理细胞4 h后同1.2.3检测线粒体HIF-3α的表达(在CoCl2处理组，线粒体HIF-3α的相对表达以β-tubulin为内参照)。
1.2.5 免疫荧光染色观察HIF-3α定位
HeLa细胞在常氧和缺氧16 h，CoCl2(终浓度0.1 mmol/L)和DMOG(终浓度0.5 mmol/L)处理4 h后用体积分数为4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100通透后，1%BSA在37 ℃下封闭30 min，用HIF-3α抗体、Grp75(主要存在于细胞线粒体的分子伴侣)抗体混合液4 ℃过夜孵育，然后用山羊抗小鼠IgG和驴抗兔IgG二抗(抗体滴度参照说明书)混合液孵育1 h，DAPI染色后封片。使用共聚焦显微镜(Nikon)观察HIF-3α与线粒体的共定位。
1.2.6 HIF-3α在ACHN细胞线粒体中的表达及定位
为探究HIF-3α在线粒体定位是否为HeLa细胞中特有的现象，我们选取了另一种肾癌细胞系ACHN细胞进行验证。ACHN细胞在常氧(0 h)及缺氧(30 h)下，以及用CoCl2(终浓度0.1 mmol/L)和DMOG(终浓度0.5 mmol/L)模拟缺氧条件处理细胞4 h，分别同上方法用Western blot检测线粒体HIF-3α的表达和免疫荧光染色观察HIF-3α定位。
1.2.7 蛋白酶敏感性实验检测HIF-3α在线粒体的亚结构定位
线粒体可分为4个亚结构：外膜、内膜、膜间隙和基质，线粒体蛋白所处的亚结构与其功能直接相关。为探究HIF-3α在线粒体的亚结构定位，我们采用了经典的酶敏感性实验。该实验中，线粒体外膜蛋白会被蛋白酶K降解，而膜内蛋白只有在加入洗涤剂后才能被蛋白酶K降解[19]。提取常氧或缺氧16 h处理后HeLa细胞的完整线粒体，并各均分成3组：未处理组、蛋白酶K处理组和蛋白酶K和10% Triton处理组。除未处理组外其它2组需在室温下孵育10~15 min，然后收集沉淀提取线粒体蛋白，用Western blot检测。
1.2.8 正常小鼠各器官组织及人肝癌组织线粒体HIF-3α的表达
以往的研究往往关注HIF-3α对转录的调控，对定位线粒体的HIF-3α知之甚少，对其临床意义也尚不明确。为探究HIF-3α定位至线粒体的生理及病理意义，我们在正常小鼠及人肝癌组织中进行了检测。常规提取C57小鼠各器官组织(包括心、肝、脾、肺、肾、脑组织)及人肝癌组织的总蛋白及线粒体蛋白，用Western blot检测HIF-3α在线粒体和组织全蛋白中的表达。
1.3 统计学方法
数据以x±s表示。采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 常氧及缺氧下HIF-3α在HeLa细胞线粒体中的表达及定位
Western blot结果显示，HeLa细胞在常氧及缺氧下线粒体中均有HIF-3α表达，且在缺氧16 h和24 h后其在线粒体的表达增加(P＜0.001，图 1A)。而在全蛋白中，HIF-3α在常氧及缺氧条件下也均有表达，且缺氧16 h和24 h后其全蛋白中的表达也增加。
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图 1 HIF-3α在HeLa细胞线粒体中的表达Figure 1. HIF-3α expressed in HeLa mitochondriaMito: Mitochondrial protein; WCL: Whole cell lysate. A: Normoxia (0 h) and hypoxia (4 h, 8 h, 16 h, 24 h); B: CoCl2 treated for 4 h; C: DMOG treated for 4 h. ** P＜0.01, *** P＜0.001, **** P＜0.000 1为进一步验证该现象，用CoCl2和DMOG模拟缺氧条件，结果显示：CoCl2和DMOG处理HeLa细胞4 h后，HIF-3α在线粒体及全蛋白中表达增加(图 1B、图 1C)。
免疫荧光染色结果(图 2)显示，常氧下，HIF-3α在细胞核中表达，同时也在线粒体表达，即HIF-3α与线粒体共定位，且缺氧16 h，或CoCl2/DMOG处理4 h后，线粒体出现核周聚集，HIF-3α与线粒体的共定位显著增加。提示：常氧下HIF-3α可定位至线粒体，缺氧进一步促进其线粒体定位。
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图 2 HeLa细胞中HIF-3α与线粒体共定位的免疫荧光染色。 ×600Figure 2. HIF-3α co-located with mitochondria in HeLa with normoxia, hypoxia (16 h) or CoCl2/DMOG treatment (4 h). ×6002.2 常氧及缺氧下HIF-3α在ACHN细胞线粒体中的表达及定位
Western blot结果显示，ACHN细胞中，HIF-3α在常氧(0 h)及缺氧(30 h)条件下也在线粒体和全蛋白表达，且缺氧后其线粒体表达增加(图 3A)。免疫荧光染色检测到与HeLa细胞相似结果(图 3B)。此外，使用CoCl2或DMOG处理后同样可增加ACHN细胞中mtHIF-3α的定位(图 3B)。
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图 3 HIF-3α在ACHN细胞线粒体中的表达及定位Figure 3. HIF-3α expressed in ACHN mitochondriaMitochondrial protein; WCL: Whole cell lysate. A: Normoxia (0 h) and hypoxia (30 h). ** P＜0.01； B: HIF-3α co-located with mitochondria in ACHN with normoxia, hypoxia (30 h) or CoCl2/DMOG treatment (4 h). ×6002.3 蛋白酶敏感性实验检测HIF-3α在线粒体的亚结构定位
结果(图 4)显示，HeLa细胞常氧或缺氧16 h处理后提取完整线粒体，在加入蛋白酶K后，HIF-3α和其它线粒体外膜蛋白如Bcl-XL、TOMM34等均未检测出，而内膜蛋白、膜间隙蛋白或基质蛋白仍可以检测到，如TIMM17A、Cyt-C等，提示HIF-3α在常氧及缺氧条件下可能定位至线粒体外膜。
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图 4 HIF-3α在线粒体的亚结构定位Figure 4. Substructural localization in mitochondria of HIF-3αA: Normoxia; B: Hypoxia (16 h)2.4 正常小鼠各器官组织及人肝癌组织线粒体HIF-3α的表达
Western blot结果显示，在正常小鼠的肝、脾、肺、肾、脑组织中均有mtHIF-3α表达，但在心脏组织未检测到mtHIF-3α表达(图 5A)，提示HIF-3α的线粒体定位现象具有组织特异性。
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图 5 HIF-3α在小鼠不同器官组织及人肝癌组织的线粒体中表达Figure 5. HIF-3α expressed in mouse tissues and human liver carcinoma mitochondriaA: Normal mouse tissues; B: Human liver tissues; Mito: Mitochondrial proteins; WCL: Whole cell lysate. a： Heart； b： Liver； c： Spleen； d： Lung； e： Kidney； f： Brain； g： Normal liver； h： Liver carcinoma； i： Tissues adjacent to cancer； GAPDH were used as cytosolic markers, HDAC1 as nuclear markers, Grp75，ATPB and Cyt-C as mitochondrial markers在人肝癌组织中，mtHIF-3α的表达相较于正常及癌旁组织明显增多(图 5B)。
3. 讨论
HIFs是一类重要的转录因子，在低氧适应反应中发挥重要作用。众所周知，HIF-αs在低氧条件下稳定并进入细胞核，与HIF-1β形成异质二聚体，并调控其靶基因表达。但有研究报道HIF-3α在胞质中的定位，如HEIKKILA等[6]研究发现在仓鼠卵巢细胞Chok1细胞中，HIF-3α4定位至胞质和核周，且在低氧条件下并不会转运至细胞核；大鼠肝细胞中，免疫荧光染色显示：HIF-3α在常氧下定位至细胞核，而在缺氧再复氧后从细胞核转运至过氧化物酶体，并可能影响到肝脏的氧化还原微环境[20]；在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞中，IPAS可定位至线粒体并促进凋亡[13]。本研究利用线粒体分离试剂盒提取得到纯度较高的线粒体，并通过Western blot检测了HIF-3α在线粒体中的表达情况，结果发现：HIF-3α在常氧及缺氧条件下确实定位线粒体，缺氧可诱导其线粒体表达增加。免疫荧光的结果也佐证了该结果。
本研究发现，HIF-3α不仅定位至细胞核(该现象与已有研究一致[15])，还可定位线粒体。关于细胞核-线粒体双定位蛋白以往也有报道，如APE1和P53蛋白。而关于线粒体定位的机制研究大部分围绕线粒体定位序列MTS的检测及线粒体膜转运蛋白如TOM家族的协作。APE1的MTS软件预测分数很低，但有研究发现它可与TOMM20互作定位线粒体[21]，且很可能是通过Mia40蛋白进入线粒体内膜[22]。而关于P53定位线粒体的机制目前认为有3种[23]：①P53与RECQL4结合(N端具有MTS序列)，再通过结合TOMM20进而转运进入线粒体[24]；②蛋白酶识别丝氨酸内切酶序列位点，活化P53从而暴露MTS序列[25]；③CHCHD4蛋白作为导入受体，共价结合P53的二硫键从而穿越线粒体外膜[26-27]。目前已知IPAS蛋白的相对分子质量约为60×103，而本研究检测到的HIF-3α相对分子质量约80×103，因此排除IPAS可能，推测可能是HIF-3α1、HIF-3α2、HIF-3α3、HIF-3α7、HIF-3α9。首先，我们通过Mitoprot ii软件对上述可能的剪切体序列进行分析，发现以上剪切体的MTS的预测值均较低，推测可能是通过其它机制如TOM家族的协作定位线粒体，后续将参考已有研究对具体机制展开研究。
现有研究显示，线粒体和HIF-3α可互相调控，如KUMAR等[12]研究发现，ROS可稳定HIF-3α表达。TORII等[13]研究报道：PC12细胞中，IPAS与线粒体共定位，并诱导线粒体去极化，线粒体核周聚集，Cyt-C释放，caspase 3通路活化，最终导致细胞凋亡。本研究发现，在缺氧或用CoCl2/DMOG处理后，线粒体出现核周聚集现象，而该现象是凋亡的标志之一[28-29]。因此我们推测：本研究发现的mtHIF-3α可能同样通过调控线粒体功能影响细胞凋亡。已有研究发现HIF-3α可作为转录因子调控其靶基因的功能[3-30-31]，因此不排除HIF-3α也可作为转录因子调控线粒体基因的可能。
HIF-3α广泛表达于人和动物体内，其mRNA主要在心脏、肺组织中表达，而在肝脏和肾脏组织中表达量较低[7]。本研究发现：HIF-3α在小鼠不同组织的线粒体及全蛋白中的表达情况存在差异，而关于HIF-3α在其它组织中表达的研究报道也有很多，如：ZOLK等[32]发现HIF-3α mRNA在心脏衰竭患者的心脏中的表达高于正常组；HIF-3α的开放阅读框在成人的胸腺、肺、脑、心脏、肾脏中表达，在脾、肝、胃中不表达[2]。HIF蛋白表达受低氧诱导，且调控过程主要发生在转录后阶段，而低氧诱导的转录后调控在心脏中只维持几分钟[32]，而线粒体蛋白提取过程需要一定时间，这可能是mtHIF-3α在心脏中未检测到的原因之一。
已有研究报道HIF-3α与肝脏疾病及肝癌相关。HIF-3α在多发性肝囊肿中表现出不正常的表达[33]。MAKINO等[3]研究发现，过表达IPAS的肝细胞癌细胞生长速度慢于对照组。杨盛力等[34]研究发现HIF-3α在肝癌组织中表达高于正常肝组织，且其表达主要位于细胞胞浆。张晓岚等[35]研究发现肝动脉插管化疗栓塞治疗可增强肝脏栓塞周围组织HIF-3α的表达，且HIF-3α可能与肝癌患者肿瘤直径、TNM分期有关，HIF-3α可作为评估肿瘤进展的标志分子。因此，本研究选取了人肝癌组织探究mtHIF-3α的表达是否与其有关。结果发现HIF-3α在肝癌组织中表达较高，这与已有研究一致，且在肝癌线粒体中的表达较正常及癌旁组织中线粒体高，提示mtHIF-3α可能参与肝癌的发生发展，这可能为肝癌的诊断及治疗提供新的思路与靶点。
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图 1 HIF-3α在HeLa细胞线粒体中的表达
Figure 1. HIF-3α expressed in HeLa mitochondria
Mito: Mitochondrial protein; WCL: Whole cell lysate. A: Normoxia (0 h) and hypoxia (4 h, 8 h, 16 h, 24 h); B: CoCl2 treated for 4 h; C: DMOG treated for 4 h. ** P＜0.01, *** P＜0.001, **** P＜0.000 1
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图 2 HeLa细胞中HIF-3α与线粒体共定位的免疫荧光染色。 ×600
Figure 2. HIF-3α co-located with mitochondria in HeLa with normoxia, hypoxia (16 h) or CoCl2/DMOG treatment (4 h). ×600
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图 3 HIF-3α在ACHN细胞线粒体中的表达及定位
Figure 3. HIF-3α expressed in ACHN mitochondria
Mitochondrial protein; WCL: Whole cell lysate. A: Normoxia (0 h) and hypoxia (30 h). ** P＜0.01； B: HIF-3α co-located with mitochondria in ACHN with normoxia, hypoxia (30 h) or CoCl2/DMOG treatment (4 h). ×600
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图 4 HIF-3α在线粒体的亚结构定位
Figure 4. Substructural localization in mitochondria of HIF-3α
A: Normoxia; B: Hypoxia (16 h)
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图 5 HIF-3α在小鼠不同器官组织及人肝癌组织的线粒体中表达
Figure 5. HIF-3α expressed in mouse tissues and human liver carcinoma mitochondria
A: Normal mouse tissues; B: Human liver tissues; Mito: Mitochondrial proteins; WCL: Whole cell lysate. a： Heart； b： Liver； c： Spleen； d： Lung； e： Kidney； f： Brain； g： Normal liver； h： Liver carcinoma； i： Tissues adjacent to cancer； GAPDH were used as cytosolic markers, HDAC1 as nuclear markers, Grp75，ATPB and Cyt-C as mitochondrial markers
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