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摘要:目的 研究沉默信息调节因子2 (silencing information regulatory 2,SIRT2)在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织的表达及临床意义。方法 免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测262例宫颈癌组织、75例CIN组织及75例正常宫颈组织石蜡标本中SIRT2蛋白的表达,并分析SIRT2蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系;采用Western blot法验证40例宫颈癌和40例正常宫颈新鲜组织标本中SIRT2蛋白的表达差异;采用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)-SIRT2沉默SIRT2在HeLa细胞中的表达,通过MTT、划痕实验检测下调SIRT2表达对HeLa细胞增殖、迁移能力的影响。结果 ① IHC结果显示,正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中SIRT2蛋白的表达逐渐升高(P<0.001)。Western blot也证实SIRT2蛋白的表达在宫颈癌组织较正常宫颈组织中高(P<0.001);② SIRT2在宫颈癌组织中高表达与宫颈癌的病理类型(腺癌)、FIGO分期高、有淋巴结转移及有高危HPV感染有关(P均<0.05),SIRT2表达水平与年龄、肿瘤分化程度、有无盆腔转移、有无累及宫颈间质及深度、有无累及颈体交界及阴道断端等无关(P均>0.05),宫颈癌SIRT2蛋白高表达组患者的死亡率高于SIRT2蛋白低表达组(P<0.05);③ shRNA-SIRT2能抑制HeLa细胞中SIRT2蛋白的表达(P<0.05),且下调SIRT2蛋白表达后,HeLa细胞的增殖和迁移能力减弱(P<0.05)。结论 SIRT2在宫颈癌变过程中可能有促进作用,SIRT2可能与宫颈癌的恶性程度发展有关。Abstract:Objective To investigate the expression level of silencing information regulatory 2 (SIRT2) in cervical cancer and CIN tissues and its clinical significance.Methods Immunohistochemistry was carried out to examine the expression of SIRT2 in 262 cases of cervical cancer tissues, 75 cases of precancerous lesions and 75 cases of normal cervical tissues, and the clinical implications of SIRT2 was further analyzed. The protein expression level of SIRT2 in 40 cervical cancer fresh tissue samples and 20 normal cervical tissue samples was detected by Western blot. shRNA-SIRT2 virus was transfected into HeLa cells to obtain the SIRT2-down-regulated HeLa cells. And the influence of down-regulation of SIRT2 on cell proliferation and migration was investigated by MTT and Scratch test.Results Immunohistochemical results showed that SIRT2 protein expression level gradually increased in cervical cancer, CIN and normal cervix tissues (P < 0.001). Western blot confirmed that SIRT2 expression level was higher in cervical cancer tissues than in normal cervix tissues (P < 0.001). The expression level of SIRT2 in cervical cancer was correlated with some factors, such as lymph node metastasis, histological type, clinical staging and HPV infection (P < 0.05). At the same time, it was independent of some factors including age, differentiation degree, pelvic metastasis, whether involving the cervical interstitial and the involvement depth and whether involving the neck junction and vaginal ends (P>0.05). Mortality in SIRT2 high expression patient group was higher than that of SIRT2 low expression patient group (P < 0.05). shRNA interference technique could effectively inhibit the expression level of SIRT2 in HeLa cells (P < 0.05). MTT assay and Scratch test indicated that down-regulation of SIRT2 expression inhibited the proliferation and migration of HeLa cells (P < 0.05).Conclusion SIRT2 may play a promoting role in the progress of cervical cancer, and SIRT2 may be related to the development of malignant degree of cervical cancer, and the inhibition of SIRT2 expression may be a potential therapeutic target for cervical cancer.
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Keywords:
- SIRT2 /
- Cervical cancer /
- Immunohistochemistry /
- Clinicopathological features /
- Survival analysis
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宫颈癌发病率在发展中国家的妇女恶性肿瘤高居第二位[1]。反复高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)发生的重要致病因素之一[2]。大多数宫颈癌患者能检测到高危型HPV的存在,而在高危型HPV中以HPV16、18型最为常见,宫颈癌患者中至少50%以上能检测到感染HPV16、18[3]。但是仅一部分受感染的女性发展为宫颈癌及少部分HPV阴性的女性发展为宫颈癌,因此可能存在其他发挥独立作用的致病因素或协同高危型HPV发挥致病作用,但其具体的致病因素和作用机制尚不清楚[4-6]。
沉默信息调节因子2 (silencing information regulatory 2,SIRT2)是Sirtuins蛋白家族成员,Sirtuins蛋白家族是近来发现的依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的第Ⅲ类组蛋白脱乙酰化酶类[7]。人类Sirtuins蛋白家族中公认的成员有7个:SIRT1~SIRT7,其功能与许多人体关键的生理病理学变化有关,例如DNA损伤、DNA修复、细胞应激、新陈代谢和调节基因的表达等,并且与寿命延长、神经变性和年龄相关的疾病等有关[7]。近年来对Sirtuins蛋白家族的研究越来越多,尤其Sirtuins蛋白家族在肿瘤发生、发展的作用引起大量学者的关注[7]。为进一步明确SIRT2在宫颈癌发生发展中的作用,本研究首次采用免疫组织化学(IHC)检测宫颈癌、CIN及正常宫颈组织中SIRT2的表达,探讨SIRT2的表达与宫颈癌临床病理特征的关系,同时采用短发夹RNA(shRNA)-SIRT2沉默在HeLa细胞中的表达,探讨其对HeLa细胞增殖、迁移能力的影响。
1. 材料与方法
1.1 资料及标本来源
收集四川大学华西第二医院2005年1月至2014年12月(除2012年1月至2013年1月)行手术治疗,并且经病理组织学检查证实确诊为宫颈癌患者(宫颈癌组,262例)、CIN患者(CIN组,共75例,包括CIN Ⅱ 35例,CIN Ⅲ 37例,原位癌3例)的临床资料及存档的石蜡标本,同时收集正常宫颈组织石蜡标本75例(正常宫颈组,其中包括因多发性子宫肌瘤行子宫全切除术35例,因子宫腺肌症行行子宫全切除术40例)。宫颈癌组患者年龄23~74岁,平均(46.40±22.55)岁;其中肿瘤高、中、低分化各35、74、153例;FIGO分期Ⅰa~Ⅰb1、Ⅰb2~Ⅱa期、Ⅱb~Ⅲ期各75、124、63例;鳞癌181例、腺癌81例;有HPV感染158例,无HPV感染104例;有淋巴结转移57例,无淋巴结转移205例;有盆腔转移129例,无盆腔转移133例;未累及宫颈间质(深度≤1/2)123例,累及宫颈间质(深度>1/2)139例;未累及颈体交界和阴道断端133例,累及颈体交界和阴道断端129例。CIN组患者年龄20~69岁,平均(43.50±20.32)岁;正常宫颈组年龄32~51岁,平均(36.40±12.36)岁。
随机选择2014年9月至2015年9月行手术治疗、并且经病理组织学检查证实确诊为宫颈癌患者的新鲜组织标本40例〔患者年龄29~57岁,平均(45.39±6.57岁)〕,正常宫颈新鲜组织标本40例〔正常宫颈取自因子宫腺肌症及子宫肌瘤行子宫全切患者,年龄25~50岁,平均(44.50±5.45岁)〕。所有组织标本手术切除后立即放入液氮保存。该研究获四川大学华西第二医院伦理委员会批准,所有参与该研究患者或患者家属均签署知情同意书。
1.2 主要试剂
HeLa细胞由四川大学华西第二医院西部妇幼研究院妇科姜长安实验室提供。SIRT2抗体(英国Abcam公司),鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Sigma公司),荧光标记鼠、兔二抗DyLight 680(美国KPL公司),IHC试剂盒DAB显色剂(DAKO公司),BSA(Solarbio公司),正常兔血清(Boster公司),EDTA(pH 9.0)抗原修复液、PBS缓冲液、苏木素染液(武汉谷歌生物科技有限公司),凝胶成像分析系统、蛋白垂直电泳槽、转膜仪(美国Bio-Rad公司),干燥烘箱、二氧化碳培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴箱(美国Thermo公司),shRNA- SIRT2序列(5′-GCTCATCAACAAGGAGAAA GC-3′)及阴性对照(shRNA NC)序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)由上海吉玛有限公司设计并合成。
1.3 实验方法
1.3.1 IHC法检测宫颈组织中SIRT2蛋白的表达
采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP)进行免疫组化染色。石蜡标本5 μm切片,常规脱蜡,梯度酒精脱水,组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复,PBS冲洗5 min×3次;3%过氧化氢室温孵育25 min(避光)阻断灭活内源性过氧化物酶,PBS冲洗5 min×3次,切片加用10%正常兔血清室温封闭30 min,在切片上滴SIRT2山羊一抗(工作浓度1:500),切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜;PBS冲洗5 min×3次,加与一抗相应种属的HRP标记二抗(工作浓度1:1 500)覆盖组织,室温孵育50 min;二氨基联苯氨(DAB)显色,苏木素复染,常规脱水、干燥、封片。结果的判定:以细胞质内有棕黄色颗粒者为染色阳性(SIRT2主要定位在细胞质中)。根据阳性染色细胞所占比例及染色强度和范围进行结果判断[8]。具体为:显微镜下随机取切片中3个高倍视野(×400),细胞染色阳性率≤25%为阴性,>25%为阳性。阳性细胞按着色强度和范围分级:阳性细胞呈淡黄色或阳性细胞率为26%~50%为弱阳性,着色强度51%~75%为中度阳性,着色强度≥75%为强阳性。以细胞染色阳性(>25%)和染色强度和范围为弱阳性(25%~50%)、中度阳性(51%~75%)、强阳性(≥75%)结果计算阳性表达率,将宫颈癌组织细胞染色阳性+染色强度和范围弱阳性判为SIRT2蛋白水平低表达,细胞染色阳性+染色强度和范围为中度阳性、强阳性判为SIRT2蛋白水平高表达。结果判断由研究者和两名经验丰富的病理医生阅片完成。
1.3.2 Western blot检测SIRT2蛋白的表达
提取新鲜宫颈组织标本组织总蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。经电泳、电转、封闭后分别与SIRT2及β-actin抗体作用(抗体滴度分别为1:1 000和1:5 000),最后采用化学发光法检测目的条带,用凝胶成像仪拍照并测定各显色条带的灰度值。以SIRT2/β-actin灰度的比值为SIRT2蛋白的相对表达量。
1.3.3 shRNA-SIRT2对HeLa细胞表达SIRT2蛋白的影响
HeLa细胞用含10%FBS、青-链霉素(100 U/mL青霉素+100 μg /mL链霉素)的DMEM培养液培养。将HeLa细胞随机分为shRNA NC组(即对照组)和shRNA-SIRT2组。细胞培养48 h后,按转染试剂盒说明书,将构建后的载体shRNA NC(5 μg /mL)和shRNA-SIRT2(5 μg/mL)分组转染入HeLa细胞。转染HeLa细胞后72 h用Western blot检测细胞中SIRT2蛋白的表达(方法同1.3.2)。
1.3.4 MTT实验检测shRNA-SIRT2对HeLa细胞增殖的影响
取生长良好的HeLa细胞,将细胞按4×103 mL-1密度接种于96孔板,培养48 h后加入shRNA-SIRT2(5 μg/mL)及shRNA NC(阴性对照,5 μg/mL),每组设3复孔,处理24 h后每孔加入15 μL、5 g/L的MTT培养箱中继续培养24、48 h,弃上清,每孔再加入150 μL的DMSO,微量振荡器振荡10 min,酶标仪测定490 nm波长处吸光度(A)值,重复实验3次,检测HeLa细胞的增殖情况。
1.3.5 划痕实验检测shRNA-SIRT2对HeLa细胞迁移能力的影响
取生长良好的HeLa细胞,以密度为4×105 mL-1接种于6孔板,培养48 h后加入shRNA - SIRT2(5 μg/mL)及shRNA NC(阴性对照,5 μg/mL),每组设3个复孔。培养24 h,待细胞铺满约80%孔,用无血清的培养基漂洗一遍,用200 μL的移液枪头垂直于培养板划“一”字划痕,1640培养基清洗细胞3次,弃上清中细胞后,每孔加入2 mL不含血清的培养基,37 ℃、体积分数为5%CO2条件下继续培养24 h、48 h,再在倒置显微镜下观察细胞的迁移情况,并以每组相应时点划痕宽度与0 h划痕宽度的比值计算24 h、48 h的相对距离。相对距离值越小,迁移能力越强。
1.4 统计学方法
计量资料数据以x±s表示,组间比较采用t检验,计数资料釆用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法,单因素分析采用log-rank检验(时序检验)。α=0.05。
2. 结果
2.1 IHC检测各组宫颈组织SIRT2蛋白的表达
如图 1所示,SIRT2阳性染色主要定位于细胞质内,阳性显色为不均质棕色颗粒。在正常宫颈组、CIN组及宫颈癌组患者的宫颈组织中SIRT2阳性表达率分别为6.67%(5/75)、37.33%(28/75)、84.73%(222/262),组间差异有统计学意义(χ2=174.115,P < 0.001),提示随着病情进展,SIRT2的阳性表达逐渐增加。
2.2 SIRT2表达与宫颈癌临床病理特征及预后的关系
将宫颈癌SIRT2表达分为低表达组和高表达组,由表 1可见,SIRT2在宫颈癌组织的表达水平在肿瘤不同临床分期、病理类型、淋巴结是否转移、是否有高危型HPV感染间的差异有统计学意义(P均<0.05)。而在患者不同年龄、分级、有无盆腔转移、有无累及宫颈间质及深度、有无累及颈体交界及阴道断端间的差异无统计学意义(P均>0.05)。截止末次随访时间(2016年12月30日)宫颈癌SIRT2高表达组患者死亡率高于SIRT2低表达组,差异有统计学意义(P < 0.001)。
表 1 SIRT2表达与宫颈癌临床病理特征及预后的关系Table 1. The relationship between SIRT2 expression and clinicopathological characteristics and prognosis of cervical cancerClinicopathological
featuresHigh SIRT2 expression
group (n=205)/case (%)Low SIRT2 expression
group (n=57)/case (%)χ2 P Age 0.382 > 0.05 ≤45 yr. 103 (79.8) 26 (20.2) > 45 yr. 102 (76.7) 31 (23.3) Degree of differentiation 0.512 > 0.05 Well-differentiated 27 (77.1) 8 (22.9) Moderately-differentiated 56 (75.7) 18 (24.3) Pooly-differentiated 122 (79.3) 31 (20.3) FIGO staging 157.420 < 0.001 Ⅰa-Ⅰb1 21 (28.0) 54 (72.0) Ⅰb2-Ⅱa 121 (97.6) 3 (2.4) Ⅱb-Ⅲ 63 (100) 0 (0) Pathological type 14.180 < 0.001 Squamous cell carcinoma 130 (71.8) 51 (28.2) Adenocarcinoma 75 (92.6) 6 (7.4) Lymphnode metastasis 5.396 < 0.05 Yes 100 (63.3) 58 (36.7) No 39 (39.0) 61 (61.0) High risk-HPV infection 14.542 < 0.001 Yes 51 (89.5) 6 (10.5) No 154 (75.1) 51 (24.9) Pelvic metastasis 2.013 > 0.05 Yes 93 (72.1) 36 (27.9) No 85 (63.9) 48 (36.1) Involvement of the stroma and the depth of the cervix 2.620 > 0.05 Yes 99 (71.2) 40 (28.8) No 76 (61.8) 47 (38.2) Involvement of the junction of the neck body and the vagina 0.053 > 0.05 Yes 89 (69.0) 40 (31.0) No 90 (67.7) 43 (32.3) Prognosis 14.799 < 0.001 Survival 139 (71.6) 55 (28.4) Death 50 (96.2) 2 (3.8) Missed 16 (100.0) 0 (0) FIGO:International federation of gynecology and obstetrics 宫颈癌SIRT2高表达组生存率低于低表达组,见图 2。
2.3 Western blot检测新鲜宫颈组织中SIRT2蛋白的表达水平
宫颈癌组及正常宫颈组SIRT2蛋白相对表达量分别为1.34±0.56、0.41±0.08,两组SIRT2蛋白表达差异有统计学意义(P < 0.000 1),见图 3。
2.4 Western blot检测shRNA-SIRT2对HeLa细胞表达SIRT2蛋白的影响
shRNA NC组和shRNA-SIRT2组SIRT2蛋白的相对表达量分别为:3.30±0.44、0.29±0.04, shRNA-SIRT2组SIRT2蛋白表达较shRNA NC组低(P < 0.001),见图 4。
2.5 MTT检测shRNA -SIRT2对HeLa细胞增殖能力的影响
shRNA-SIRT2组细胞24、48 h增殖能力低于shRNA NC组(P<0.05),见图 5。
2.6 划痕实验检测shRNA -SIRT2对HeLa细胞迁移能力的影响
shRNA-SIRT2组细胞24 h、48 h的迁移距离分别为(62.51±13.44) μm、(68.00±13.38) μm,shRNA NC组为(128.83±17.59) μm、(211.34±23.96) μm,shRNA-SIRT2组细胞在同一时间点的迁移能力较shRNA NC组弱,差异有统计学意义(P<0.001),见图 6。
3. 讨论
妇科肿瘤中最常见是宫颈癌,其次是子宫内膜癌和卵巢癌[9]。宫颈癌的发生发展是一个极其复杂、步骤繁多的过程。目前已有研究证实HPV是宫颈癌最主要的致病因素[10],并且同一亚型的高危HPV反复感染是宫颈癌发生的最主要原因[11]。但宫颈癌具体发病机制尚不明确,除外HPV感染,相关癌基因的激活及抑癌基因的失活、以及其他内源性因素和外源性因素也是影响宫颈癌发生发展的重要因子[12]。
研究显示,SIRT2通过使抑癌底物分子脱乙酰化从而发挥作用,如Forkhead转录因子(forkhead box protein O1,Foxo1),细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20,CDC20),乙酰化组蛋白H3K56 (histone acetyltransferase acetylating histone H3 lysine 56,H3K56)等,这些都是重要的维持细胞内环境稳定的分子[13],若其功能障碍则可导致遗传的不稳定性和肿瘤的发生。另有研究发现Sirtuins家族对H3KW部位的染色质有去乙酰化作用,是调控葡萄糖代谢的重要基因,抑制有氧糖代谢和Myc依赖核糖体合成, 缺失该基因将导致代谢迅速的重编程并促进肿瘤发生[14]。
本研究结果显示,宫颈癌组织中SIRT2蛋白的表达高于CIN组织和正常宫颈组织,CIN组织中的表达高于正常宫颈组织,即SIRT2蛋白在正常宫颈组织、CIN组织及宫颈癌组织中的表达水平逐步增加。同时采用Western blot检测新鲜宫颈组织标本,也验证了SIRT2在宫颈癌组织中的表达量高于正常宫颈组织,提示在正常宫颈发生为宫颈癌的过程中,SIRT2可能促进其发生,具有肿瘤启动子的特性。并且有报道[15-19]显示SIRT2在急性髓性白血病、神经母细胞瘤、胰癌和晚期肝癌等肿瘤中高表达,与在宫颈癌中高表达一致,也具有肿瘤启动子的特性。
本研究还发现,SIRT2在宫颈癌的表达水平在肿瘤临床分期越高、组织病理类型为腺癌、有淋巴结转移、感染高危型HPV和死亡或失访者高表达(P均<0.05),在不同患者年龄、肿瘤分化程度、有无盆腔转移、有无累及宫颈间质及深度、有无累及颈体交界及阴道断端间的差异无统计学意义(P均>0.05)。
据文献报道,宫颈腺癌约占宫颈癌的2%~5%,且宫颈腺癌的发病率呈上升趋势,从5%上升为15.1%~18.5%,并且发病人群趋于年轻化[20-23]。本研究结果显示,SIRT2在腺癌中的表达水平高于鳞癌,提示SIRT2可能与宫颈癌的恶性发展相关,是促进宫颈癌进一步恶化的重要因子。
盆腔淋巴结的转移是决定宫颈癌患者治疗方案、手术范围及患者预后情况的重要因素,目前主要依靠影像学手段如CT、MRI等来判断有无淋巴结的转移,而部分影像学检查花费昂贵,术前术后的多次检查给部分患者造成极大的经济负担,若能发现独立的生物学肿瘤指标能准确的预测是否有盆腔淋巴结的转移,将对对患者疾病的判断有重大意义[24-25]。本研究结果发现,SIRT2的表达水平与有盆腔淋巴结转移有关,提示SIRT2蛋白水平的高表达可能是判断宫颈癌有无盆腔淋巴结转移的危险因素指标之一。
感染HPV往往导致良性的上皮组织病变,但若反复感染相同的高危型HPV(如HPV16、HV18),则将极大增加发展为宫颈癌的风险。高危型HPV产物E6蛋白可以通过结合抑癌基因p53,从而通过刺激泛素化介导p53的降解,同样,高危型HPV产物E7蛋白通过结合pRB肿瘤抑制蛋白,并促进其降解从而促进肿瘤的发生[26]。本研究结果发现,SIRT2的表达水平在有高危型HPV16、18感染的患者中明显增高,提示SIRT2可能协同HPV导致宫颈癌的发生,另有研究报道HPV16 DNA在侵袭性肿瘤中明显增高,与肿瘤的侵袭性相关[5-6],而我们的研究也提示SIRT2可能与宫颈癌的恶性程度相关。
运用Kaplan-Meier法绘制SIRT2低表达组及高表达组的生存曲线图,我们发现宫颈癌患者的生存率在SIRT2高表达组较SIRT2低表达组低,提示高表达SIRT2与宫颈癌患者生存率可能相关,应进一步扩大样本量验证。
本研究通过shRNA干扰HeLa细胞表达SIRT2蛋白,从而获得稳定下调SIRT2蛋白水平的HeLa细胞,发现下调HeLa细胞表达SIRT2蛋白后可减弱HeLa细胞的生长、增殖、迁移能力。有文献报道SIRT2抑制剂tenovin-6抑制SIRT2在胃癌细胞中的表达,可引起内质网应激诱导胃癌细胞系中的死亡受体5上调,从而导致胃癌细胞死亡增加[27-28],其作用机制可能与SIRT2在宫颈癌中的一致。研究发现在原发性肝癌细胞中SIRT2的上调与血管浸润、肿瘤分期、淋巴结转移和生存率显着相关,通过抑制肝癌细胞系中SIRT2的表达水平对其运动性和侵袭性有显著抑制[8],与本研究结论一致。
综上所述,SIRT2可能参与了宫颈癌的发生发展过程,减弱SIRT2的表达可能抑制宫颈癌恶性程度的发展,希望为宫颈癌的靶向治疗提供前期研究的理论依据,提供新的潜在治疗靶点。
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表 1 SIRT2表达与宫颈癌临床病理特征及预后的关系
Table 1 The relationship between SIRT2 expression and clinicopathological characteristics and prognosis of cervical cancer
Clinicopathological
featuresHigh SIRT2 expression
group (n=205)/case (%)Low SIRT2 expression
group (n=57)/case (%)χ2 P Age 0.382 > 0.05 ≤45 yr. 103 (79.8) 26 (20.2) > 45 yr. 102 (76.7) 31 (23.3) Degree of differentiation 0.512 > 0.05 Well-differentiated 27 (77.1) 8 (22.9) Moderately-differentiated 56 (75.7) 18 (24.3) Pooly-differentiated 122 (79.3) 31 (20.3) FIGO staging 157.420 < 0.001 Ⅰa-Ⅰb1 21 (28.0) 54 (72.0) Ⅰb2-Ⅱa 121 (97.6) 3 (2.4) Ⅱb-Ⅲ 63 (100) 0 (0) Pathological type 14.180 < 0.001 Squamous cell carcinoma 130 (71.8) 51 (28.2) Adenocarcinoma 75 (92.6) 6 (7.4) Lymphnode metastasis 5.396 < 0.05 Yes 100 (63.3) 58 (36.7) No 39 (39.0) 61 (61.0) High risk-HPV infection 14.542 < 0.001 Yes 51 (89.5) 6 (10.5) No 154 (75.1) 51 (24.9) Pelvic metastasis 2.013 > 0.05 Yes 93 (72.1) 36 (27.9) No 85 (63.9) 48 (36.1) Involvement of the stroma and the depth of the cervix 2.620 > 0.05 Yes 99 (71.2) 40 (28.8) No 76 (61.8) 47 (38.2) Involvement of the junction of the neck body and the vagina 0.053 > 0.05 Yes 89 (69.0) 40 (31.0) No 90 (67.7) 43 (32.3) Prognosis 14.799 < 0.001 Survival 139 (71.6) 55 (28.4) Death 50 (96.2) 2 (3.8) Missed 16 (100.0) 0 (0) FIGO:International federation of gynecology and obstetrics -
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