临床上经常会遇到皮肤损伤修复异常的情况，如在糖尿病等疾病状态下，创口迟迟不能愈合，存在损伤修复困难的情况；而在修复过度或修复失调时，则会形成瘢痕，影响美观。成纤维细胞是真皮中数量最多的细胞，也是皮肤损伤修复最重要的细胞之一^[1]，对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有重要作用^[2]。因此探明成纤维细胞增殖的调控机制无疑对于促进皮肤损伤修复具有十分重要的理论意义和应用价值。已知成纤维细胞的增殖受到多种因素调节，包括细胞外基质^[1]、生长因子^[3]、细胞因子^[4]、多肽^[5]等，尽管如此，其调控机制尚远未完全阐明。研究表明，亨廷顿蛋白相关蛋白1（Huntingtin-associated protein 1，Hap1）可以促进下丘脑神经元增殖^[6]，却对乳腺癌细胞的增殖有抑制作用^[7]。Hap1基因对成纤维细胞增殖的作用未见报道。本实验通过体内体外实验对Hap1基因与成纤维细胞增殖之间的关系进行研究，并初步探索Hap1基因影响成纤维细胞增殖的机制，为促进正常的皮肤损伤修复提供实验基础。

1.   材料与方法

1.1   动物、主要试剂和主要仪器

C57BL/6J Hap1基因敲减（Hap1^+/−）小鼠来自Jackson实验室，C57BL/6J野生型小鼠来自简阳达硕动物科技有限公司。所有小鼠饲养在恒温环境中（25±1）℃，12 h光/暗周期，可自由获取水和饲料。

主要试剂和仪器：PCR Master Mix、PrimeScript逆转录试剂盒和TB GreenqPCR试剂盒购自TaKaRa公司，DNA Marker购自天根生化，高糖DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自灏洋生物公司，EdU细胞增殖流式检测试剂盒购自锐博生物公司，通用SP试剂盒（兔链霉卵白素-生物素法检测系统）购自北京中杉金桥公司，兔抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体购自Abcam公司，兔抗波形蛋白（Vimentin）抗体购自博士德公司；PCR仪和实时定量PCR仪购自BIO-RAD公司，流式细胞仪购自Beckman公司，数字扫描显微成像系统购自Precipoint公司。

1.2   实验方法

1.2.1   成纤维细胞的体外分离培养及鉴定

1.2.1.1   PCR鉴定杂交子代小鼠Hap1基因的敲除

用Hap1^+/−基因型的雌雄小鼠（来自Jackson实验室）杂交获得子代，取新生鼠尾巴，加50 mmol/L NaOH 180 μL，沸水浴1 h，加1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）20 μL，离心上清即为DNA溶液。引物见表1。PCR总反应体系25 μL。反应程序95 ℃预变性3 min，变性95 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，成像观察结果定性判定基因型。

表  1  Hap1基因鉴定引物

Table  1.  Hap1 gene identification primer

Gene name	Sequence
WT	F: 5′ -TTTTGGAGGTCTGGTCTCGCTCTG-3′
	R: 5′ -CTTCATGTGGATGCTAGGGATCC-3′
Hap1	F: 5′ -GTGGCGCTGAGTCTGGATTGAC-3′
	R: 5′ -TACCCTACCCGGTAGAATTCG-3′
WT: Wild type

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1.2.1.2   成纤维细胞的分离培养

取Hap1敲除（Hap1^-/-）组和野生型（WT）组胎鼠背部皮肤，用组织块培养法获得原代细胞，采用含100 mL/L胎牛血清和10 mL/L双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基于37 ℃、50 mL/L CO₂的条件下培养，用于后续实验。

1.2.1.3   免疫荧光法染成纤维细胞

细胞爬片用纯甲醇固定，PBS洗涤，滴加封闭液，室温封闭1 h；滴加一抗Vimentin（1:1000，成纤维细胞标记），4 ℃湿盒过夜；PBS洗涤，滴加二抗，室温避光孵育1 h；PBS洗涤，滴加DAPI（1:1000），室温避光孵育5 min；PBS洗涤，滴加抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察。

1.2.1.4   实时荧光定量PCR（qPCR）法验证Hap1^-/-组细胞中Hap1的表达

成纤维细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基培养至正常生长，胰酶消化得细胞悬液，用Trizol法提取细胞总RNA，测RNA浓度；每个样本取1 μg RNA逆转录为cDNA。以β-actin为内参，取逆转录的cDNA进行qPCR，引物见表2。反应程序95 ℃预变性30 s，变性95 ℃ 5 s，退火延伸60 ℃ 30 s，共40个循环。用2^–ΔΔCt法进行计算基因的相对表达量。

表  2  qPCR引物序列

Table  2.  Primers used in qPCR

Gene name	Sequence	Product length/bp
β-actin	F: 5′ -AGATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′	147
	R: 5′ -ACTCATCGTACTCCTGCTTGCT-3′
Cdc25C	F: 5'-CCATTACTACGGTTCCTAAGCTGA-3'	176
	R: 5'-GCCAGACTCTTCCTCCTCCATC-3'
E2f7	F: 5'-CTTGCCTGTCCTGTGACCATG-3'	155
	R: 5'-TCTGGATTTCTTGCCGGGTT-3'
E2f8	F: 5'-GACACCCAAAGGCTCCCAGTT-3'	159
	R: 5'-TCAGTTGAGACTTCCAGTTTGCG-3'
Ccl5	F: 5'-CGTCAAGGAGTATTTCTACACCAGC-3'	101
	R: 5'-ACTTCTTCTCTGGGTTGGCACA-3'
Hap1	F: 5′ -CGTGCGGCGTTTATTCGAG-3′	131
	R: 5′ -GCTGTGTTCAGGTCCCGTTC-3′

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1.2.2   5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）染色检测细胞增殖

取成纤维细胞，以每孔细胞密度3×10⁵接种于培养皿，培养至第2天，按1:1 000在培养基中加入EdU溶液，孵育12 h和24 h，其余操作见说明书。染色完成后上流式细胞仪检测，分析EdU阳性细胞比例。

1.2.3   流式细胞法检测细胞周期

取成纤维细胞，在无血清条件下饥饿培养6 h后，改用含100 mL/L胎牛血清培养基培养24 h，胰酶消化得细胞悬液，将单细胞悬液1 500 r/min离心5 min，弃上清后加入PBS离心洗涤1次，弃上清加入300 μL PBS重悬细胞，加入700 μL酒精，4 ℃固定过夜，离心弃上清，PBS洗涤，加入含50 μg/mL RNase A的PI染液中孵育30 min后，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.4   转录组测序

取成纤维细胞，无血清培养6 h后，改用含100 mL/L血清的DMEM培养基培养，胰酶消化得细胞悬液，加Trizol后干冰保存送上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组测序。其结果以Hap1^-/-组与WT组的比值（fold change）表示，>1为基因表达增加，<1为基因表达减少。

1.2.5   qPCR检测细胞增殖相关基因

成纤维细胞无血清培养6 h后，改用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基培养，胰酶消化得细胞悬液，用Trizol法提取细胞总RNA，测RNA浓度；每个样本取1 μg RNA逆转录为cDNA进行qPCR。以β-actin为内参，引物见表2，反应条件同1.2.1.4。

1.2.6   小鼠皮肤损伤模型的建立

取WT和Hap1^+/-成年小鼠各12只，腹腔注射水合氯醛麻醉，背部用脱毛剂脱毛，标记手术部位，常规消毒背部皮肤，做一直径为0.8 cm的皮肤损伤创口，深达皮下但不伤及肌肉组织。手术后小鼠单独喂养，并保持创口干燥，不沾染异物。

1.2.7   创面面积测定

手术当天记为d0，伤后第1天记为d1，以此类推，分别于d0手术结束、d1、d3、d5、d7、d9、d11和d13拍照，直至创口完全愈合（结痂掉落，正常皮肤完全覆盖创口），用Image J软件测量创口面积。损伤面积（%）=现损伤面积/原损伤面积×100%。

1.2.8   免疫组织化学染色检测小鼠皮肤增殖细胞核抗原（PCNA）的表达

皮肤损伤术后3 d，麻醉小鼠，取创口及周围5 mm以内的皮肤组织，制作石蜡切片后行免疫组织化学染色标记PCNA（1:100）。每例动物标本连续切片，随机等距抽取3张片子，染色后用Precipoint M8扫描系统成像，400倍镜下每张片子选取3～5个视野（伤口结痂处与皮下肌组织之间的区域，避开肌肉组织和炎症组织），用ViewPoint软件测量视野面积并计数其内的阳性细胞数（阳性信号位于细胞核，呈棕色），然后计算阳性细胞密度（阳性细胞数/相应区域面积）。

1.3   统计学方法

数据均采用$\bar x \pm s$表示。多重比较用方差分析，两两比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   原代成纤维细胞培养结果

新生鼠基因型鉴定结果见图1。有WT（仅有550 bp条带）、Hap1^−/−（仅有350 bp条带）和Hap1^+/−（出现550 bp和350 bp两条带）三种基因型（图1A）；组织块里爬出的细胞呈长梭形、漩涡样生长，两组形态一致（图1B），免疫荧光染色标记Vimentin，两组细胞胞质均呈强阳性（图1C），证明成功培养了原代成纤维细胞；WT组成纤维细胞表达Hap1基因（相对表达量1×10^–4），而Hap1^−/−组的成纤维细胞不表达Hap1基因（相对表达量0），敲除成功。

图  1  原代成纤维细胞培养及鉴定

Figure  1.  Primary fibroblast culture and identification

A: PCR; B:5 d cultured fibroblasts, ×200; C: Primary fibroblast Vimentin immunofluorescence staining (red for Vimentin, blue for nuclear DAPI) ×200

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2.2   EdU增殖检测和细胞周期结果

见图2。EdU孵育12 h和24 h时，Hap1^−/−组的EdU阳性细胞比例分别为15%和24.6%，低于同时点的WT组（分别为26.8%和42.1%），且差异有统计学意义（P<0.05）（图2A）；流式细胞法检测细胞周期，发现Hap1^−/−组成纤维细胞进入S期的比例减少，与WT组相比，差异有统计学意义（P<0.05）（图2B）。

图  2  Hap1敲除后成纤维细胞增殖能力

Figure  2.  Fibroblast proliferation after Hap1 knockout

A: EdU cell proliferation flow detection peak map; B: Fibroblast growth cycle detection a: WT group; b: Hap1^-/- group; 1:12 h; 2:24 h

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2.3   转录组测序及qPCR验证结果

分析转录组测序结果发现（图3A），11种与细胞增殖相关的基因表达有差异（图3B），进一步查阅数据库中与细胞增殖关系密切的基因，选择了Cdc25C、E2f7、E2f8和Ccl5基因；qPCR验证发现Hap1敲除后，Hap1^−/−组细胞周期负性调节因子E2f7和E2f8较WT组表达增多（分别为0.576 vs. 0.288和0.7542 vs. 0.357），其中E2f7的表达差异有统计学意义（P<0.05），而Cdc25C和Ccl5在WT组和Hap1^−/−组的表达差异无统计学意义（图3C）。

图  3  Hap1敲除后成纤维细胞中细胞周期相关因子表达水平

Figure  3.  Expressions of cell cycle-related factors in fibroblasts after Hap1 knockout

A: Transcriptome sequencing results; B: Cell proliferation-related genes; C: qPCR validation results. *P<0.05. The gray lines in A and B indicate that the expression level has not changed

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2.4   小鼠皮肤损伤修复及免疫组化结果

测量小鼠皮肤伤口面积，两种基因型之间差异有统计学意义（P<0.01，图4）。皮肤损伤修复结果显示，Hap1^+/-鼠伤口完全恢复需要13 d，而WT鼠仅需11 d（图5A）；损伤第3天损伤处组织样本做PCNA的免疫组织化学染色（图5B），Hap1^+/−组的增殖阳性细胞密度较WT组低（9×10^–4/μm² vs. 1.4×10^–3/μm²），且差异有统计学意义（P<0.01）。

图  4  小鼠皮肤损伤面积测量

Figure  4.  Changes in skin lesion areas in mice

*P<0.05, vs. WT group at the same time point

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图  5  小鼠皮肤损伤修复及细胞增殖能力

Figure  5.  Skin damage repair and cell proliferation in mice

A. Changes in skin lesions over time; B: 3d lesion tissues PCNA immunohistochemical staining (1: ×100；2:×400), the arrows point to the damaged surface. a: WT group; b: Hap1^+/- group

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3.   讨论

Hap1是胞浆蛋白，主要在神经元表达。早期对Hap1的研究结果集中于其在神经元囊泡运输中的作用，例如Hap1与驱动蛋白轻链（kinesin light chain，KLC）相互作用参与轴突的顺向运输^[8]；后来发现Hap1不仅参与中枢神经元囊泡运输，还参与外周部分内分泌细胞的胞内转运，如胰岛β细胞分泌胰岛素^[9]等；此外，还发现Hap1参与表面受体的再循环和信号转导，如Hap1通过抑制γ-氨基丁酸A型受体降解，促进受体循环，调节突触受体数^[10]。以上研究结果说明，Hap1功能多样，在体内发挥着重要的生理作用。

2014年XIANG等^[11]发现，神经球敲除Hap1后，细胞的BrdU阳性率降低，体内实验也发现Hap1敲除的小鼠大脑皮质、下丘脑、小脑中BrdU阳性细胞数量明显减少。该研究小组2015年再次报道^[6]，在小鼠出生第1天时敲除Hap1，海马齿状回的BrdU阳性细胞数量减少。这些研究表明Hap1不仅参与了神经细胞增殖，而且对其增殖有正向调控作用。同样，我们的研究结果发现，Hap1对成纤维细胞的增殖也具有正向调控作用。我们首先在体外实验观察到，Hap1敲除小鼠的成纤维细胞增殖减慢，然后经细胞流式检测细胞周期，发现进入细胞增殖周期S期的细胞减少。S期主要是DNA合成，是完成细胞复制的重要时期，说明Hap1对成纤维细胞增殖的影响主要是在S期。因为成纤维细胞是真皮组织中数量最多的细胞，也是皮肤损伤后修复最重要的细胞之一^[1]，所以我们进一步通过在体皮肤损伤实验对体外细胞实验结果进行验证。结果发现，Hap1敲减（因Hap1敲除小鼠无法存活，所以用杂合子小鼠做此实验）小鼠皮肤损伤修复需要更长的时间，免疫组化染色显示皮损修复区的增殖细胞数量减少（如上所述，因成纤维细胞是真皮组织的主要细胞成分，所以本实验将PCNA阳性细胞视作成纤维细胞）。为了初步探究Hap1对成纤维细胞增殖的影响机制，我们做了转录组测序，因为转录组测序可以获得某一状态下组织或细胞内所有转录产物（包括mRNA和非编码RNA）序列信息，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然联系。用qPCR对测序结果进行验证，发现Hap1敲除的成纤维细胞E2f7表达增加。已有研究表明，Hap1可以与TATA结合蛋白^[12]等转录因子相互作用来调节基因转录。E2f家族是经典的转录因子，E2f7是其中的非典型性E2f，在细胞周期中起负性调节作用。非典型性E2f抑制因子活性增加，可以下调大量细胞周期基因的表达，导致细胞周期严重阻滞。已有研究表明，过表达E2f7显著降低小鼠胚胎成纤维细胞的原代增殖^[13]，异位表达可以延缓S期进展^[14]。本实验结果显示，Hap1敲除的成纤维细胞E2f7表达增多，细胞周期分析结果显示，进入S期的细胞减少，与已知实验结果相吻合。

本研究结果提示，Hap1可能通过抑制细胞周期负性调控因子E2f7的表达，对成纤维细胞的增殖发挥正向调控作用，从而促进成纤维细胞增殖及皮肤损伤修复。但我们的研究未能揭示Hap1影响E2f7的具体途径及E2f7作用的下游分子，对整个调节过程涉及的信号通路还有待进一步的研究。本研究无法使用Hap1^-/-小鼠完全复制和验证体外细胞实验的结果，使用杂合子Hap1^+/-小鼠得到的结果，其机制或许与使用纯合子Hap1^-/-小鼠相同（只是强度不同），或许掩盖了另外一些只有在纯合子中才能发现的机制，有待探讨。