口腔鳞状细胞癌（oral squamonus cell carcinoma, OSCC）是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤之一。国外最新研究发现口腔癌死亡率每年递增0.4%^[1-2]，特别是有转移的晚期患者死亡率明显增加。癌症转移复发是患者死亡的主要原因，而上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤发生转移的重要过程^[3]。尽管目前的治疗手段不断趋于成熟，但由于肿瘤的局部侵袭及复发转移仍会造成其患者生存率降低，因此对OSCC生长转移的相关分子机制的研究是广大研究者亟需攻克的难题。

酪氨酸激酶受体2（tyrosine kinase receptor 2, Tie2）是受体酪氨酸激酶家族中的一员。作为一种促血管生成因子，Tie2在调节炎症、肿瘤的血管生成中均发挥重要作用；研究表明Tie2在多数实体肿瘤中如乳腺癌^[4]、卵巢癌^[5]、肝癌^[6]等都存在异常高表达，Tie2的表达能促进肿瘤的血管生成，加速肿瘤的生长转移；目前，Tie2在OSCC生长转移中的作用研究较少。本实验研究了OSCC中Tie2的表达水平，并利用RNA干扰技术研究沉默Tie2对OSCC细胞增殖、克隆、迁移能力及EMT过程的影响，为后期进行靶向药物治疗、提高患者生存率提供新思路。

1.   材料与方法

1.1   临床标本和细胞株

选取2019年1月–2021年6月在四川省医学科学院·四川省人民医院口腔颌面外科接受手术且临床资料完整的OSCC患者。其中男性95例，女性62例，年龄28～81岁，中位年龄56岁。术前未行放化疗，术后病理学检查结果均为OSCC。本研究经四川省医学科学院·四川省人民医院医学伦理委员会批准（批准号2019年第328号），所有患者均知情同意。人口腔黏膜癌前病变细胞（DOK）及口腔鳞癌细胞株HSC-4、SCC-9、Cal-27、HSC-3由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室馈赠。

1.2   主要材料和试剂

兔抗人Tie-2单克隆抗体（亲科生物研究中心有限公司，江苏），山羊抗兔/鼠HRP标记聚合物（三鹰生物技术有限公司，武汉），纤丝状肌动蛋白（F-actin）（Abcam，美国），ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI，蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）抗体，p-AKT抗体，胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）抗体，p-ERK抗体（Cell Signaling Technology，美国），全蛋白提取试剂盒（索莱宝科技有限公司，北京），Cell Counting Kit-8试剂盒（白鲨生物科技有限公司，上海），Transwell小室（Coring，美国），神经钙黏素（N-cadherin）抗体（Affinity，中国），上皮钙黏素（E-cadherin）抗体（Affinity，中国），波形蛋白（vimentin）抗体（Affinity，中国）。

1.3   实验方法

1.3.1   免疫组织化学（IHC）检测OSCC和正常口腔黏膜组织中Tie2的表达

取组织标本蜡块连续切片，脱蜡水化，抗原修复，3%过氧化氢阻断，山羊血清封闭，加一抗（1∶100），4 ℃冰箱过夜。PBS冲洗，加入二抗，作用1 h，PBS冲洗，DAB显色，苏木精衬染，盐酸酒精分化，脱水，中性树胶封片，观察。根据染色强度和阳性细胞比例判定结果^[7]。

1.3.2   shRNA慢病毒载体的合成

根据NCBI人源Tie2基因序列，设计合成针对Tie2的3条重组慢病毒干扰序列：Tie2-shRNA-161、162、163；同时设计合成1条不针对任何靶基因的阴性对照序列：shRNA-429。由成都豪乙生物科技有限公司合成并进行序列测序鉴定，见表1。

表  1  四种双链shRNA序列

Table  1.  Four double-stranded shRNA sequences

Gene	Sequence
Tie2-shRNA-161	5′-TGGGTGACATTTGGGAGACAT-3′
Tie2-shRNA-162	5′-GCTACCTACTAATGAAGAAAT-3′
Tie2-shRNA-163	5′-CCCACTCCAATTTGACCCATA-3′
Negative-shRNA-429	5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3'

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.3.3   慢病毒转染

将HSC-4和SCC-9细胞（Tie2高表达细胞株）以密度为4×10⁴ mL⁻¹接种于6孔板中，通过预实验，确定转染最适条件为MOI=60。加入所需病毒量及助染剂，感染约72 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，加入质量浓度为2.5 μg/mL的嘌呤霉素筛选细胞株，直到在荧光显微镜的白光与绿色荧光下细胞形态基本一致约80%左右，确定感染成功。

1.3.4   CCK-8检测细胞增殖能力

HSC-4和SCC-9细胞各分为实验组shRNA-162和对照组shRNA-429。调整细胞悬液浓度为2×10³ mL⁻¹，加入96孔板（100 μL/孔）中培养，在不同时间点（1、2、3、4、5 d）加入10 μL CCK8溶液于每孔内，培养2 h，酶标仪测定492 nm处的光密度（optical density, OD）值，绘制增殖曲线。

1.3.5   克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

细胞分组同1.3.4。按800细胞/皿的细胞数接种到5 cm皿中，培养2周，每2～3 d更换培养基，待细胞出现克隆团时，去除培养液，体积分数为4%多聚甲醛固定20 min，0.2%结晶紫染色15 min。洗去染色液，干燥，拍摄细胞克隆形成情况，以肉眼计数克隆形成数量，取平均值。

1.3.6   单细胞培养检测细胞克隆形态

细胞分组同1.3.4。提取细胞悬液，采取有限稀释法将细胞连续数倍稀释到极低密度，将稀释好的细胞悬液接种于96孔板，每孔加0.1 mL培养基。选取只含1个细胞的孔，划好标记，补加0.1 mL培养基，继续培养2周，观察细胞克隆情况。拍照并计算每孔中的细胞群落数，克隆形成率=克隆数÷接种细胞数×100%。

1.3.7   细胞划痕实验检测细胞运动能力

细胞分组同1.3.4。将密度为3×10⁵ mL⁻¹细胞悬液接种于6孔板中，培养24 h，以垂直于水平线方向作一宽度均匀的划痕，PBS清洗3次，显微镜下定点拍照（0 h、48 h），采集图像。结果用Image J软件计算细胞迁移的距离进行统计学分析。

1.3.8   Transwell检测细胞迁移能力

细胞分组同1.3.4。将细胞密度为1.0×10⁵ mL⁻¹的100 μL细胞悬液加入预冷的Transwell上室中，下室加入600 μL完全培养基，孵育48 h。吸净上室、下室液体，PBS洗3次。用棉签将上室细胞擦净，下室加入甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色15～20 min。PBS清净染料，显微镜下观察。计数显微镜下每个视野中迁移细胞数，共计数9个视野，取均值。

1.3.9   激光共聚焦显微镜检测细胞E-cadherin、N-cadherin和骨架F-actin重塑

细胞分组同1.3.4。检测E-cadherin和N-cadherin表达：①固定。用镊子小心取出盖玻片放入孔板中（注意区分细胞面与非细胞面），用预热的PBS轻轻洗涤2次，加入体积分数为4%多聚甲醛避光固定20 min。②封闭。弃去多聚甲醛，加入PBS清洗3×5 min，用含1%Triton-100的5%BSA（用PBS溶解）溶液室温封闭30 min。③一抗孵育。弃去封闭液，取载玻片加入用含1%Triton X-100的1%BSA（用PBS溶解）溶液稀释的一抗（E-cadherin、N-cadherin）（1∶100），放入湿盒4 ℃过夜。④二抗孵育。取载玻片用PBS清洗3×5 min，加入用1%BSA（含1%Triton X-100）溶液稀释的荧光二抗（1∶100），避光37 ℃孵育1 h。

检测骨架F-actin重塑：①细胞骨架染色。取载玻片避光条件下用PBS清洗3×5 min，加入30 μL已稀释的F-actin（浓度：100 nmol/L），放入湿盒室温孵育30 min。②DAPI染色。取载玻片避光条件下用PBS清洗3×5 min，取30 μL DAPI于干净载玻片上，吸干四周水分倒置于载玻片上，避光室温静置15 min。③封片。在盖玻片四周刷一层指甲油封片。激光共聚焦显微镜观察染色结果，计数显微镜下每个细胞中丝状伪足数，共计数约30个细胞，取均值。

1.3.10   Western blot

采用Western blot检测Tie2高表达细胞株，同时检测沉默Tie2基因后EMT相关标志性蛋白和AKT、ERK蛋白的表达（细胞分组同1.3.4）。收集不同处理的细胞，加入提前配置好的细胞裂解混合液〔含0.1%的蛋白酶抑制剂，0.5%苯甲基磺酰氟（PMSF），1%磷酸酶抑制剂 〕放置于冰上充分裂解，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清至新的EP管中，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度并处理蛋白制备样本。配置SDS-PAGE电泳，聚偏氟乙烯（PVDF）膜转膜，5%脱脂牛奶（TBST溶解）室温封闭1 h。封闭结束后取出膜，用TBST洗3×5 min（90 r/min）分别加入1∶1000稀释的抗Tie2、抗E-cadherin、抗N-cadherin、抗vimentin、抗AKT、抗p-AKT、抗ERK、抗p-ERK、抗β-actin抗体，4 ℃摇床过夜孵育（90 r/min）。取出孵育过夜的膜，TBST清洗3×10 min（90 r/min）后，加入5%脱脂牛奶稀释的山羊抗兔二抗（1∶2 000）、羊抗鼠二抗（1∶2 000），室温孵育2 h。孵育结束后，取出膜用TBST清洗3×10 min（90 r/min）。用ECL发光显影液显色，Chemidoc XRS采集图像。Image G软件分析条带灰度值，以目的条带灰度值与内参（β-actin）条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.4   统计学方法

数据均以$ \bar x \pm s $表示。采用χ²检验或t检验， α=0.05。

2.   结果

2.1   Tie-2在OSCC及正常口腔黏膜组织中的表达情况

IHC结果（图1）显示：在157例OSCC标本中，Tie2阳性率约74.5%（117/157）。而正常黏膜组阳性表达率为19.4%（6/31）。OSCC组Tie-2的阳性率高于正常黏膜组（P<0.0001）。

图  1  OSCC组织（A）和正常口腔黏膜组织（B）中 Tie2的免疫组化染色结果。 ×100

Figure  1.  Immunohistochemical staining results for Tie2 in OSCC tissues (A) and normal mucosal tissues (B). ×100

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   DOK细胞及4种口腔鳞癌细胞株中Tie2的表达情况

Western blot结果显示（图2）：Tie2在DOK细胞及4种OSCC细胞株中均有所表达，相比DOK细胞，HSC-4中Tie2的表达水平最高（5.608±0.246），其次是SCC-9，Tie2 的表达量为3.901±0.123。因此，选择HSC-4、SCC-9作为实验细胞株以供后续实验。

图  2  Tie2在不同细胞株中的表达情况

Figure  2.  Expression of Tie2 in different cell lines

^*** P<0.001, ^**** P<0.0001, vs. DOK cells.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   慢病毒转染情况及沉默Tie2效果

将3条慢病毒干扰序列（shRNA-161，shRNA-162，shRNA-163）成功转染至HSC-4、SCC-9后，Western blot检测HSC-4、SCC-9细胞株中Tie2蛋白敲减效率，结果显示：shRNA-162组中Tie2的表达最低（HSC-4中为0.652±0.003；SCC-9中为0.716±0.042)，低于shRNA-429对照组（HSC-4中为1.000±0.050；SCC-9中为1.000±0.042)（P<0.0001）（图3）。筛选沉默效果最好的shRNA-162组作为实验组，供后续实验。

图  3  HSC-4（A）、SCC-9（B）细胞株稳定转染病毒后Tie2的表达

Figure  3.  Expression of Tie2 in HSC-4 (A) and SCC-9 (B) cell lines after stable transfection with virus

a: shRNA-429; b: shRNA-161; c: shRNA-163; d: shRNA-162. ^* P<0.05, ^**** P<0.0001, vs. a.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   沉默Tie2后对细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示：shRNA-162实验组的细胞增殖能力弱于shRNA-429对照组（P<0.05）（图4A）。说明沉默Tie2的表达能抑制HSC-4、SCC-9细胞增殖能力。

图  4  Tie2对HSC-4、SCC-9细胞增殖能力的影响

Figure  4.  Effect of Tie2 on the proliferation ability of HSC-4 and SCC-9 cells

A: the CCK-8 assay; B: the clone formation assay; C: the single-cell clonal culture. ^* P<0.05, ^*** P<0.001, ^**** P<0.0001, vs. shRNA-429 cells.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

克隆形成实验结果显示：两组细胞中，shRNA-162实验组的克隆数量较shRNA-429对照组下降，克隆形成能力降低（HSC-4中shRNA-162实验组为121.000±28.350，shRNA-429对照组为391.000±46.800；SCC-9中shRNA-162实验组为37.000±8.869，shRNA-429对照组为128.000±8.641）（P<0.0001）（图4B）。说明沉默Tie2的表达能抑制HSC-4、SCC-9细胞的克隆形成能力。

单细胞培养结果显示：培养2周后HSC-4、SCC-9细胞均可见3种不同的克隆形态：全克隆（holoclone）、部分克隆（meroclone）、亚克隆（paraclone）；其中全克隆细胞呈圆形或卵圆形，形态规则，排列整齐，边缘光滑，具有很高的增殖能力；亚克隆细胞形态不规则，边界不清晰，细胞较为松散；部分克隆介于全克隆和亚克隆之间。与shRNA-429对照组相比，shRNA-162实验组全克隆形成率下降，亚克隆形成率增加（P<0.05，P<0.001）（图4C）。说明沉默Tie2能抑制细胞的克隆增殖能力。

2.5   沉默Tie2后对细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示：在HSC-4、SCC-9细胞划痕48 h后，与shRNA-429对照组相比，shRNA-162实验组划痕愈合率降低（HSC-4细胞划痕愈合率由59.260%±3.704%降至15.480%±2.728%；SCC-9细胞划痕愈合率由35.220%±2.882%降至24.360%±5.875%）（P<0.05，P<0.0001）（图5A）。说明沉默Tie2能抑制HSC-4、SCC-9细胞的运动能力，其运动能力减弱。

图  5  Tie2对HSC-4、SCC-9细胞迁移能力的影响

Figure  5.  Effect of Tie2 on the migratory ability of HSC-4 and SCC-9 cells

A: cell scratch assay; B: Transwell assay; a: HSC-4; b: SCC-9.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

Transwell实验结果显示：两组细胞中，shRNA-162实验组较shRNA-429对照组细胞迁移能力减弱〔细胞迁移数量HSC-4由(198.300±42.360)/field降至(77.750±10.050)/field；SCC-9由(78.600±8.735)/field降至(42.600±3.050)/field〕（P<0.01，P<0.0001）（图5B）。说明沉默Tie2能抑制HSC-4、SCC-9细胞迁移能力。

2.6   沉默Tie2对细胞骨架F-actin重塑的影响

激光共聚焦显微镜检测结果显示：与shRNA-429对照组相比，shRNA-162实验组细胞骨架F-actin绿色荧光强度降低，细胞表面光滑，放大处可见细胞前缘丝状伪足数量减少（P<0.01）、长度变短，同时细胞质中应力纤维未能清晰可辨（图6）。这表明沉默Tie2的表达可以降低HSC-4、SCC-9细胞骨架F-actin荧光强度，减少细胞前缘丝状伪足数量，降低其运动迁移能力，明显抑制细胞骨架F-actin重塑。

图  6  激光共聚焦显微镜检测HSC-4（A）、SCC-9（B）中细胞骨架F-actin表达情况和丝状伪足的数量。 ×100

Figure  6.  Cytoskeletal F-actin expression and the number of filamentous pseudopods in HSC-4 (A) and SCC-9 (B) cells were determined by confocal laser scanning microscope (Confocal). ×100

^** P<0.01, vs. shRNA-429.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.7   沉默Tie2对细胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表达的影响

Wetern blot结果显示：与shRNA-429对照组比较，shRNA-162实验组E-cadherin的蛋白表达水平增加，N-cadherin、vimentin的蛋白表达水平降低（P<0.0001）。表明沉默Tie2可能对EMT的进展具有抑制作用（图7A），提示Tie2可能参与了OSCC的EMT过程。

图  7  HSC-4、SCC-9细胞E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白的表达

Figure  7.  The expression of E-cadherin, N-cadherin, and vimentin proteins in HSC-4 and SCC-9 cells

A: Western blot; B: confocal laser scanning microscope (×200); a: shRNA-429; b: shRNA-162. ^**** P<0.0001, vs. a.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

激光共聚焦显微镜检测结果显示：与shRNA-429对照组相比，shRNA-162实验组细胞E-cadherin的表达明显增加，荧光强度明显增强，而N-cadherin的表达明显降低，荧光强度明显减弱（图7B）。表明沉默Tie2可能对EMT的进展具有抑制作用，进一步验证了上述结果。

2.8   沉默Tie2对细胞中AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白表达的影响

结果显示：与shRNA-429对照组相比，shRNA-162实验组p-AKT（SCC-9细胞）、p-AKT/AKT、p-ERK、p-ERK/ERK的表达降低（P<0.05），ERK的表达增加（P<0.01）（图8）。表明沉默Tie2对AKT及ERK信号通路具有抑制作用。

图  8  Western blot检测HSC-4、SCC-9细胞中AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表达

Figure  8.  Western blot was performed to determine the expression of AKT, p-AKT, ERK, and p-ERK proteins in HSC-4 and SCC-9 cells

a: shRNA-429; b: shRNA-162. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^**** P<0.0001, vs. a.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

Tie2最早于1992年由ZIEGLER等^[8]从人的胎盘中克隆发现，该基因位于9p21染色体上，共编码约1124 个氨基酸。Tie2主要表达于血管内皮细胞表面，随着研究的深入发现其在单核巨噬细胞、周细胞、肿瘤细胞表面均有所表达^[9]，Tie2不仅在正常组织如胚胎发育中的血管分化发挥作用，在病理状态下如炎症、肿瘤中的血管生成中也扮演重要的角色。

肿瘤的增殖、迁移与肿瘤的血管生成密切相关，而Tie2作为一种内皮细胞特异性受体，在肿瘤的血管生成中发挥着重要作用，大量研究^{[6, 10-12]}证实在肝癌、胶质母细胞瘤和宫颈癌等多种肿瘤中，Tie2充当着促癌基因的角色，Tie2高表达对肿瘤的血管生成具有促进作用，阻断Tie2信号可以减少肿瘤相关内皮细胞的血管生成，对抑制肿瘤细胞的增殖、转移十分重要^[13]。有学者^[14]曾利用IHC检测发现Tie2在OSCC组织中的阳性表达率明显高于正常组织，且与病理分级成正相关，这与本实验的结果相一致。同时，本实验结果显示，沉默Tie2的表达能抑制OSCC细胞的增殖克隆以及迁移能力，并且利用激光共聚焦显微镜检测了Tie2对细胞骨架F-actin表达的影响，结果显示：沉默Tie2后，细胞骨架F-actin绿色荧光强度减弱，丝状伪足明显减少，细胞的运动、迁移能力减弱。这也进一步验证了沉默Tie2能抑制OSCC细胞的迁移能力，说明Tie2在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。

EMT被认为是癌症转移的重要过程；由于上皮细胞间极性消失，黏附能力下降，逐渐向间充质型转化，获得其结构和功能特征，细胞的运动性及迁移能力增强，最终导致肿瘤细胞的转移扩散^{[3, 15]}；主要特征表现为上皮标志物表达减少， 间质标志物表达增加^[16]。在此过程中，大量信号分子如转化生长因子β、血管内皮生长因子等刺激多种信号通路，激活部分EMT转录因子如ZEB家族、Snail和Twist的表达，促进EMT的发生^[17]。研究发现OSCC的生长转移伴随有EMT的发生，如在OSCC患者中发现E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平显著降低，且在低分化及有淋巴结转移的OSCC患者中更为明显，这提示E-cadherin与OSCC生长转移及病理分级密切相关，被认为是OSCC的高危标志物^[18-19]。本实验通过沉默Tie2的表达对EMT相关蛋白进行检测，结果显示沉默Tie2的表达可以改变OSCC中EMT相关标志性蛋白的表达，如上皮标志物E-cadherin表达的增加，间质标志物如N-cadherin、vimentin表达的降低，提示沉默Tie2对OSCC的EMT进展具有抑制作用，从而抑制OSCC的生长转移。

ERK及AKT都是十分经典的信号传导途径，由于各种因素的刺激，ERK及AKT发生磷酸化而得以激活，从而对细胞的增殖分化迁移发挥调控作用^[20]；研究发现，Tie2可通过刺激ERK、AKT等下游信号通路对肿瘤细胞的增殖转移发挥重要作用^[21]。在口腔癌细胞中，miR-1179表达的下降能抑制ERK及AKT的磷酸化水平，进而使口腔癌的生长与增殖得到抑制^[22]。这提示ERK及AKT信号均参与肿瘤细胞的增殖迁移等过程，并发现其与肿瘤化疗过程中的耐药也存在密切关系^[23]；为进一步阐明Tie2在OSCC增殖转移过程中的分子机制，本研究对Tie2的下游信号ERK及AKT的表达进行了检测，结果显示在口腔鳞癌细胞株中，沉默Tie2后，p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK、p-ERK/ERK的表达降低，ERK的表达增加；这表明沉默Tie2能通过抑制AKT及ERK的磷酸化，从而调控OSCC细胞的生长增殖。这与前期的学者研究一致。

综上所述，Tie2在OSCC组织中的表达明显高于正常黏膜组织，沉默Tie2可通过调控AKT及ERK信号通路，抑制OSCC细胞增殖克隆迁移能力，抑制OSCC细胞骨架F-actin的重塑，改变OSCC细胞EMT相关标志性蛋白的表达，提示Tie2可能参与了OSCC的生长、转移及EMT过程；后续课题组将研究Tie2的配体血管生成素（angiopoietin, Ang）在OSCC中的作用，并进行体内动物实验进一步验证Tie2及其配体Ang对OSCC增殖转移能力以及其对口腔癌颌骨侵犯的影响，为治疗晚期及复发转移的口腔鳞癌患者提供一种新的治疗靶点，从而为提高其生存率提供可能。

*　　　　*　　　　*

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突