Effect of Lipoteichoic Acid Synthesis-Related Gene dltD on Acid Tolerance of Highly Cariogenic Strains of Streptococcus mutans
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摘要:目的 通过构建变异链球菌593(Streptococcus mutans 593, SM593)dltD基因缺失株,探究dltD在SM593耐酸能力中的作用和可能机制,为龋病的生态防治提供理论依据。方法 ①同源重组构建SM593 dltD基因缺失株SM593-ΔdltD;②采用全自动生长曲线分析仪绘制在不同pH培养条件下SM593和SM593-ΔdltD的生长曲线,比较二者耐酸能力;通过SM593和SM593-ΔdltD不同时间点的菌落计数(colony forming unit, CFU)计算其生存率并比较二者耐酸反应(acid tolerance response, ATR)能力;③通过不同pH条件下的糖酵解能力检测、质子通透性检测、质子移位膜腺苷三磷酸酶(H+-ATPase)活性检测初步探究dltD基因缺失影响耐酸的可能机制。结果 ①PCR及测序结果显示SM593 dltD基因缺失株构建成功;②随着培养基pH逐渐降低,SM593-ΔdltD生长减缓,当培养基pH=5.0时无法生长,与 SM593相比耐酸能力下降;SM593-ΔdltD与SM593相比ATR能力下降;③不同pH条件下,SM593-ΔdltD与SM593相比,糖酵解能力无明显差异,质子通透性增加(P<0.05),H+-ATPase活性下降(P<0.05)。结论 dltD基因缺失株较原始株相比耐酸能力明显下降,可能是由于dltD基因缺失导致质子通透性显著增强、H+-ATPase活性显著降低,从而使菌株维持胞内pH稳态能力下降所致。Abstract:Objective To study the role and possible mechanism of dltD in the acid tolerance of Streptococcus mutans 593 (SM593), and to provide a theoretical basis for the ecological prevention and control of dental caries by constructing the dltD gene deletion strain of SM593 (SM593-ΔdltD).Methods 1) SM593-ΔdltD was constructed by homologous recombination. 2) The growth curve of SM593 dltD and SM593-ΔdltD under different pH culture conditions was drawn by the automatic growth curve analyzer to compare their acid tolerance. Colony forming unit (CFU) at different time points was used to calculate the survival rate and to compare the acid tolerance response (ATR) of SM593 and SM593-ΔdltD. 3) Under different pH conditions, glycolysis experiments, proton permeability test and H+-ATPase activity test were conducted to make preliminary exploration into the mechanisms of how dltD gene deletion may affect acid tolerance.Results 1) PCR and sequencing results showed that the SM593-ΔdltD was constructed successfully. 2) With decreasing pH value of the culture medium, the growth of SM593-ΔdltD slowed down. When the pH value of the culture medium was 5.0, SM593-ΔdltD was not allowed to grow, and its acid tolerance was lower than that of SM593. Compared with SM593, the ATR capability of SM593-ΔdltD was decreased. 3) SM593 dltD and SM593-ΔdltD did not show obvious difference in their glycolysis ability under different pH conditions. Compared with SM593 dltD, the proton permeability of SM593-ΔdltD under different pH conditions was increased significantly (P<0.05), and H+-ATPase activity decreased significantly (P<0.05).Conclusion Compared with SM593 dltD, SM593-ΔdltD showed obvious decrease in acid tolerance, which may be caused by the significant increase in proton permeability and significant decrease in the H+-ATPase activity induced by the deletion of the dltD gene, hence reducing its ability to maintain intracellular pH homeostasis.
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Keywords:
- Streptococcus mutans /
- dltD /
- Acid tolerance
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龋病是最常见的口腔流行病之一[1],第四次全国口腔健康流行病学调查报告显示,我国35岁以上人群患龋率高达89%以上[2]。变异链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans or SM)是龋病发生的关键病原菌之一[3],同时具备产酸和耐酸能力,能够适应牙菌斑生物膜内pH快速且极端变化,在酸性环境中持续生存、代谢产酸,最终导致牙体硬组织脱矿、龋齿形成[4]。SM耐酸能力包括两个部分:固有耐酸能力、耐酸反应(acid tolerance response, ATR)能力。ATR是指诱导的耐酸能力,即通过将指数生长期的细菌置于亚致死性pH环境中生长,从而提高其在致死性pH环境中的生存率[5]。SM的耐酸机制主要包括以下几方面:细胞内pH稳态维持、新陈代谢改变、大分子的保护与修复和双组分感应系统调控[6]。
脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)是革兰阳性菌细胞壁的重要组成成分,也是革兰阳性菌重要的表面抗原,有助于维持细菌膜稳态和毒力[7]。不同菌株的LTA侧链取代基不同,D-丙氨酸(D-alanine, D-Ala)是SM胞壁LTA侧链的主要取代基[8]。D-Ala 通过dlt操纵子调控的D-丙氨酰化掺入LTA, dlt操纵子由dltA、dltB、dltC、dltD四个基因组成,目前dltA、dltB和dltC的功能已明确, 但dltD的功能尚未明确[9]。近年有学者发现,在大鼠的龋病模型中,SM UA159 dltD变异株与原始株相比致龋力显著下降,体外实验结果显示该变异株对氧化应激的耐受能力明显下降[10],据此推测dltD可能参与调节SM对外界环境压力的耐受。SM致龋力包括形成生物膜的能力、产酸能力及耐酸能力[3],其中耐酸能力与其对外界环境压力耐受密切相关。
本课题组前期分别从高龋患者(龋失补指数≥6且龋失补牙面数≥10,并且有两个以上未充填的龋洞)和无龋健康人(龋失补指数=0)口内分离获得血清C型SM临床株593号(Streptococcus mutans 593, SM593)和SM临床株18号(Streptococcus mutans 18, SM18)[11],通过一系列体外致龋力实验比较发现,SM593致龋能力明显强于SM18,经强酸处理后SM593活菌数明显多于SM18[12]。前期预实验结果显示SM593 dltD表达量显著高于SM18,据此推测,高致龋力株SM593的耐酸能力与dltD有关。
本研究通过构建SM593 dltD基因缺失株,探究dltD对SM593耐酸能力的影响,并从细胞内pH稳态维持和新陈代谢改变方面初步探究其影响耐酸的机制,为阐明dltD在SM中的功能以及SM的耐酸机制提供理论依据,为龋病生态防治提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
主要试剂:2×Taq PCR master Mix(Biomiga,中国);BHI培养基(OXIOD,英国);DNA纯化试剂盒(New England Biolabs,美国);Luria-Bertani(LB)培养基(OXIOD,英国) ;T4 DNA连接酶(New England Biolabs,美国);Taq DNA Polymerase(New England Biolabs,美国);感受态刺激肽(competent stimulating peptide, CSP)(上海生工生物,中国);马血清(Solarbio,中国);细菌基因组提取试剂盒(Zymo Research,美国);质粒小提试剂盒(Zymo Research,美国);壮观霉素(spectinomycin, spe)(Sigma公司,美国);甘氨酸(麦克林,中国);Tris-HCl缓冲液(弗得生物,中国);丁醇(汕头市西陇化工,中国);甲苯(汕头市西陇化工,中国);磷酸钾缓冲液(弗得生物,中国);硫酸镁溶液(MgSO4,弗得生物,中国);氯化钾(KCl,弗得生物,中国);氯化镁溶液(MgCl2,弗得生物,中国);氢-钾ATP酶测试盒(南京建成,中国);氢氧化钾(KOH,汕头市西陇化工,中国)。
主要仪器:PCR仪(ABI2720,Applied Biosystems,美国);低温高速离心机(CF16R XII,日本日立工机有限公司,日本);电泳仪(DYCP-31CN,北京六一生物科技有限公司,中国);多功能酶标仪(SpectraMaxM5e,美国);恒温摇床(NRT-100B,上海培因实验仪器有限公司,中国);凝胶成像系统(BIODOC-IT-220,UVP公司,中国);全自动生长曲线分析仪(Bioscreen C MBR,芬兰);细菌厌氧培养箱(DG250,Don Whitley Scientific,英国);紫外可见分光光度计(UV-5200,上海元析仪器有限公司,中国);pH计〔FE28,梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司,中国 〕。
1.2 菌株及培养条件
本实验所用菌株血清C型SM593临床株(四川大学华西口腔医学院惠赠并由本实验室保存,SM593来源如前所述[11-12])采用BHI液体培养基培养。基因缺失菌株采用含 1 mg/mL spe的BHI液体培养基培养。SM593的培养条件为 37 ℃厌氧培养(厌氧混合气体含体积分数10% CO2、10% H2、80% N2)。大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α(New England Biolabs,美国)采用含0.1 mg/mL spe的LB液体培养基培养。E. coli培养条件为37 ℃、200 r/min振荡,需氧培养。
1.3 SM593 dltD基因缺失株的构建
SM593 dltD序列与SM UA159序列一致,因此参考NCBI提供的SM UA159全基因组序列,利用Premier 5.0软件设计SM593 dltD基因上、下游引物(表1)。采用PCR扩增SM593 dltD基因上、下游片段,琼脂糖凝胶电泳确定片段大小无误后,分别对片段进行双酶切,经过纯化后,分别在T4 DNA连接酶作用下与pFW5质粒(淼灵质粒平台)进行连接,并使用E.coli DH5α感受态细胞进行转化。采用含0.1 mg/mL spe的LB培养基过夜培养,筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒进行测序鉴定。使用终质量浓度1 mg/mL的CSP刺激SM593,同时加入10 μg线性化质粒混合均匀,进行转化。转化完成后,梯度稀释上述菌液,并涂布于含 1 mg/mL spe的BHI琼脂平板,厌氧培养,筛选阳性克隆。提取阳性克隆的DNA进行PCR及测序鉴定。将得到的SM593 dltD基因缺失株命名为SM593-ΔdltD。
表 1 本实验所用引物Table 1. Primers used in this experimentPrimer name Sequence Application dltD-up-F 5′-CGGATCCCCGTTTTATGCTGTTTATGCCTACT-3′ 5′ fragment for dltD mutation dltD-up-R 5′-CCCAAGCTTAAACTGGCCCCAAAATCAACC-3′ dltD-down-F 5′-CCCATGGGGGCCACTTATACTGGTAATCCT-3′ 3′ fragment for dltD mutation dltD-down-R 5′-CCCCCGGGACAGCTCTCACCGTCTTTCA-3′ dltD-in-F 5′-TGGTTCGTTCCAAAGGGGAC-3′ dltD sequencing confirmation dltD-in-R 5′-CGATCCGCTGTACTTCCTGT-3′ aad9-F 5′-TTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGAC-3′ spe sequencing confirmation aad9-R 5′-GCCACTGCATTTCCCGCAATATCT-3′ 1.4 不同pH条件下SM593和SM593-ΔdltD生长曲线测定
分别复苏SM593及SM593-ΔdltD,挑取单菌落置于5 mL BHI液体培养基中过夜培养。分别将过夜培养的菌液与不同pH (7.5、6.0、5.5、5.0)BHI液体培养基以体积比1∶20接种,取200 μL混合后的菌液于全自动生长曲线分析仪,参数设置为波长600 nm,每隔0.5 h检测一次光密度(optical dencity, OD)值,时长24 h,采用等体积的BHI培养基作为空白对照。Graphpad Prism 8.0绘制生长曲线。
1.5 SM593和SM593-Δ
dltD ATR能力检测 菌株复苏及培养同前。取指数生长中期菌液,4 000 r/min、4 ℃离心5 min,弃上清液。酸诱导组加入等体积的BHI液体培养基(pH=5.5)重悬,直接酸化组加入等体积的BHI液体培养基(pH=7.5)重悬,培养 2 h后离心,弃上清液,PBS漂洗。置于甘氨酸缓冲液(0.1 mol/L,pH3.5)每隔15 min取50 μL梯度稀释涂板计数,计算细菌随时间变化的生存率。
1.6 不同pH条件下SM593和SM593-ΔdltD糖酵解能力检测
菌株复苏及培养同前。取指数生长中期菌液,PBS漂洗后重悬于不同pH(pH=7.5、pH=5.5)的0.5 mmol/L磷酸钾缓冲液(含1.25 mmol/L MgCl2和37.5 mmol/L KCl)中,调整OD600 nm≈0.5。加入终浓度为1%(W/V)葡萄糖,在120 min内以15 min为间隔监测pH值,根据不同时间点测得的pH值绘制糖酵解曲线。
1.7 不同pH条件下SM593和SM593-ΔdltD质子通透性检测
菌株复苏及培养同前。取平台生长期菌液离心,去培养基,记录菌体质量。5 mmol/L MgCl2清洗1次,以5 mg/mL的质量浓度重悬于 PBS缓冲液(pH=7.4,含50 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2),37 ℃孵育2 h后离心,弃上清,以20 mg/mL重悬于不同pH(pH=7.5、pH=5.5)PBS缓冲液(含50 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2)。用100 mmol/L HCl(或 KOH)将菌液调至pH4.5以下,取5 mL菌液,每10 min测量菌液pH。在50 min时加入终浓度10%的丁醇,使细胞内外达到pH平衡。80 min时记录最终pH。
1.8 不同pH条件下SM593和SM593-ΔdltD H+-ATPase活性检测
菌株复苏及培养同前。分别绘制细菌干重与OD600 nm值关系曲线:取指数生长中期的菌液,4 ℃离心,去培养基,收集菌体;用75 mmol/L Tris-Hcl(pH=7.0,含10 mmol/L MgSO4)缓冲液洗涤2次,重悬于10 mL 75 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0, 含10 mmol/L MgSO4)缓冲液;取5 mL菌液放置于已称重的干净离心管中,放于烤箱中,烤干称重(W2,单位:mg),细菌干重=W2-W1,W1为干净离心管的质量(单位:mg);剩余的5 mL菌液稀释成各种浓度,测定其在600 nm处的吸光度;以菌液细胞质量浓度(mg/mL)为横坐标,以吸光度为纵坐标,做出细胞干重与吸光度的关系曲线。H+-ATPase活性检测前, 取指数生长中期的菌液,4 ℃离心,去培养基,收集菌体;75 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0,含10 mmol/L MgSO4)缓冲液洗涤2次,离心,去上清,保存于−80 ℃冰箱备用。使用前于−80 ℃冰箱取出,室温下融化,重悬在20 mL、75 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0,含10 mmol/L MgSO4)缓冲液中,加入0.2 mL甲苯,震荡90 s后,离心,除去上层悬浮物。将菌体重悬于不同pH值(pH=7.5、pH=5.5)75 mmol/L Tris-HCl(含10 mmol/L MgSO4)中,吸取2 mL菌液,测量菌液OD600 nm值,根据细菌干重与吸光度曲线的关系,用于推算菌液浓度。将上述制备好的细胞按照氢-钾ATP酶测试盒说明书进行操作。将测定出的结果代入公式:ATPase活力=(测定管OD值-对照管OD值)÷标准管OD值×0.1 μmol×6÷细菌干重,计算得到H+-ATPase活力值。
1.9 统计学方法
以上实验均每组设置3个样本,重复3次。数据以
$\bar x \pm s $ 表示,组间比较采用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1
SM 593-Δ dltD鉴定结果 SM593 dltD基因缺失株鉴定结果显示,BHI琼脂平板内长出具有spe抗性的菌落为疑似dltD基因缺失株(图1A);采用引物dltD-in-F/R进行PCR,产物琼脂糖凝胶电泳结果(图1Ba)显示PCR产物大小491 bp,第7、9泳道菌株为疑似dltD基因缺失株;采用dltD-in-F/R和aad9-F/R进行PCR,产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图1Bb)显示1、2泳道模板DNA为SM593-ΔdltD,引物依次为dltD-in-F/R(产物大小491 bp)和aad9-F/R(产物大小535 bp),3、4泳道模板DNA为SM593,引物依次为dltD-in-F/R和aad9-F/R,5、6泳道分别为dltD-in-F/R和aad9-F/R的阴性对照,结果显示上述步骤选取的疑似dltD基因缺失株基因组dltD完全被spe抗性基因取代;对上述结果筛选出的疑似dltD基因缺失株测序结果显示同PCR结果一致,SM593 dltD基因缺失株SM593-ΔdltD构建成功(图1C)。
图 1 SM593 dltD基因缺失株鉴定结果Figure 1. Identification result of SM593 dltD gene deletion strainA: Positive re-cloning screening (containing 1 g/L spectinomycin); Ba: The gel electrophoresis result of the suspected dltD gene deletion strain is primarily screened by PCR; Bb: The gel electrophoresis result of the suspected dltD gene deletion strain is verified by PCR; C: BLAST results of sequencing of suspected dltD gene deletion strains.2.2 不同pH条件下
SM 593-Δ dltD生长曲线 随着培养基pH逐渐下降,SM593-ΔdltD的生长速率减缓,到达平台期时的OD600 nm明显下降,当培养基pH=5.0时,SM593能够继续生长,SM593-ΔdltD则无法继续生长(图2)。与SM593相比,SM593-ΔdltD耐酸能力下降。
2.3
SM 593-Δ dltD ATR能力检测结果 在致死性酸作用下,SM593与SM593-ΔdltD的生存率均出现下降,在每个检测时间点SM593-ΔdltD的生存率均低于SM593;经酸诱导后,SM593与SM593-ΔdltD的生存率均增加,但SM593-ΔdltD的酸诱导组在45 min时的生存率比SM593的酸诱导组下降3个log值,表明与SM593相比SM593-ΔdltD ATR能力下降(图3)。
2.4 不同pH条件下
SM 593-Δ dltD糖酵解能力检测结果 在pH=7.5的条件下SM593和SM593-
ΔdltD在120 min的pH均值分别为3.72和3.96,在pH=5.5的条件下SM593和SM593- ΔdltD在120 min的pH均值分别为3.41和3.71,由此可见在上述pH条件下SM593-ΔdltD均具备糖酵解能力,且均能够将环境pH值降至4.0以下,二者糖酵解能力没有显著差异(图4)。 2.5 不同pH条件下
SM 593-Δ dltD质子通透性检测结果 在pH=7.5和pH=5.5的条件下SM593-
ΔdltD的终末pH值均低于SM593(P<0.05),该结果表明在相同的时间内流入SM593- ΔdltD的质子量大于SM593,因此SM593- ΔdltD的质子通透性强于SM593(图5)。 2.6 不同pH条件下
SM 593-Δ dltD H+-ATPase活性检测结果 在不同的pH条件下SM593-ΔdltD的H+-ATPase活力值均小于SM593(P<0.05)。该结果表明与SM593相比,SM593-
ΔdltD H+-ATPase活性降低(图6)。 3. 讨论
dlt操纵子调控SM胞壁LTA的D-丙氨酰化,由dltA、dltB、dltC、dltD四个基因组成。dltA、dltB、dltC、dltD分别编码不同的蛋白,参与SM胞壁LTA的D-丙氨酰化过程[13]。有学者在SM中发现,dltC失活后无法在pH低于6.5的培养基中生长,ATR结果显示,经亚致死的酸诱导后其在致死性pH条件下的生存率明显低于原始株[14]。低pH条件下dlt操纵子表达上调可能是细菌耐酸反应的一部分[10],当戈登链球菌处于酸性环境中时,其dlt操纵子表达显示出上调趋势[15]。据此推测,本实验中dltD缺失导致酸性条件下菌株dltD表达无法上调,因此耐酸能力下降。
SM在低pH条件下持续进行糖酵解是其重要的耐酸机制之一[16]。糖酵解需要相对稳定的内环境,当外界pH较低时,细菌细胞内外将产生质子梯度差,为维持细菌细胞内相对稳定的内环境,SM通过降低膜的质子通透性阻挡质子内流,同时增强H+-ATPase活性,将质子转运到细胞外[17]。通过上述机制SM能够维持细胞内环境稳态,保持相对碱性的胞质pH,以保护糖酵解相关蛋白酶和胞内正常生理活动[17]。本实验从胞内pH稳态维持和糖酵解方面对dltD基因的耐酸机制进行初步探究,结果表明在不同的pH条件下,SM593-
ΔdltD表现出质子通透性增强、H+-ATPase活性降低的特点。 dltD参与LTA D-丙氨酰化[11],LTA D-丙氨酰化可通过增加细胞壁密度的方式减少阳离子抗菌肽渗透进入细胞[18]。dltD缺失可能导致LTA D-丙氨酰化程度降低、细胞壁密度降低,使得SM593-
ΔdltD表现出质子通透性增强的特点。另外,质子通透性还与细胞膜脂肪酸比例有关,细胞膜不饱和脂肪酸比例越高,细胞的质子通透性越强[19]。H+-ATPase活性也与细胞膜脂肪酸比例有关,细胞膜不饱和脂肪酸比例越高,H+-ATPase活性越低。在双歧杆菌中发现,其在平台期的耐酸能力强于指数生长期,通过对两种生长期细菌胞膜脂肪酸检测发现,指数生长期细胞膜不饱和脂肪酸比例较平台期高,H+-ATPase活性呈下降趋势[20]。H+-ATPase是位于细胞膜上的一种应激蛋白,能够将质子转运到细胞外,与细胞外环境相比,可以使细菌胞内保持相对碱性的胞质pH环境[21]。SM ATR机制的研究表明,SM能够改变其在酸性条件下的生理状态并长期在酸性环境中生存与H+-ATPase密切相关[16]。由此可见,dltD缺失导致菌株质子通透性增强,质子内流量增多,与此同时H+-ATPase活性下降,细菌泵出质子能力下降,不利于细菌维持胞内相对碱性的pH环境,因此耐酸能力下降。 虽然本实验结果显示SM593-
ΔdltD维持细胞内pH稳态的能力下降,但是不同pH条件下其糖酵解能力与SM593相比并未发生明显改变。糖酵解属于SM的初级代谢,对维持细菌的生存具有非常重要的作用。SM糖摄入系统主要包括两种:磷酸转移酶系统(phosphatase transfer system, PTS)、非磷酸转移酶系统(non-phosphatase transfer system, NPTS)[22]。葡萄糖通过PTS系统进入细胞质,在指数生长期会诱导dlt操纵子表达[23]。糖酵解过程中的相关蛋白酶也会受到酸性环境的影响,有研究证明糖酵解过程的关键酶烯醇化酶最适pH为7.8,但该酶最适pH会随环境pH的降低而改变,当SM在pH5.5的条件下生长时,该酶的最适pH会根据环境调整为7.0[23]。此外,糖酵解相关的其他酶类在酸性环境中呈现表达上调趋势,例如SM LT11在pH 5.0环境下葡萄糖激酶上调2.1倍,葡萄糖-6-磷酸异构酶上调了2倍,丙酮酸激酶4个亚型的表达分别上调2.4、7.1、2.3和7.8倍[24]。综上所述, dltD缺失后dltA、dltB、dltC可能被诱导表达以代偿dltD的功能;酸性条件下糖酵解相关蛋白酶也可出现上调,推测二者共同维持了SM593- ΔdltD的糖酵解能力,因此在本实验中并未检测到SM593- ΔdltD糖酵解能力发生改变。 本文初步探究了dltD在SM中的功能,结果表明dltD缺失后,菌株质子通透性增强、H+-ATPase活性降低,导致SM593耐酸能力下降。耐酸能力是SM重要的致龋力之一,可维持SM在酸性环境中存活并持续代谢产酸,从而破坏脱矿和再矿化平衡,最终导致釉质脱矿龋病发生。已有研究证明,在大鼠的龋病模型中,SM UA159 dltD变异株与原始株相比致龋力显著下降[10],本实验结果证明dltD缺失后高致龋力株SM593耐酸能力下降,因此dltD可作为潜在的防龋药物调控靶点,以减少龋病的发生。
* * *
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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图 1 SM593 dltD基因缺失株鉴定结果
Figure 1. Identification result of SM593 dltD gene deletion strain
A: Positive re-cloning screening (containing 1 g/L spectinomycin); Ba: The gel electrophoresis result of the suspected dltD gene deletion strain is primarily screened by PCR; Bb: The gel electrophoresis result of the suspected dltD gene deletion strain is verified by PCR; C: BLAST results of sequencing of suspected dltD gene deletion strains.
表 1 本实验所用引物
Table 1 Primers used in this experiment
Primer name Sequence Application dltD-up-F 5′-CGGATCCCCGTTTTATGCTGTTTATGCCTACT-3′ 5′ fragment for dltD mutation dltD-up-R 5′-CCCAAGCTTAAACTGGCCCCAAAATCAACC-3′ dltD-down-F 5′-CCCATGGGGGCCACTTATACTGGTAATCCT-3′ 3′ fragment for dltD mutation dltD-down-R 5′-CCCCCGGGACAGCTCTCACCGTCTTTCA-3′ dltD-in-F 5′-TGGTTCGTTCCAAAGGGGAC-3′ dltD sequencing confirmation dltD-in-R 5′-CGATCCGCTGTACTTCCTGT-3′ aad9-F 5′-TTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGAC-3′ spe sequencing confirmation aad9-R 5′-GCCACTGCATTTCCCGCAATATCT-3′ -
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期刊类型引用(1)
1. 黄珊,杜景云,李艺君,吴敏婧,陈帅,江山,黄晓晶. LiaSR双组分信号转导系统调控变异链球菌耐酸和生物膜形成能力的机制研究. 中华口腔医学杂志. 2024(01): 54-63 . 百度学术
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