欢迎来到《四川大学学报(医学版)》

四硫代钼酸铵抑制铜转运蛋白-1用于胰腺癌治疗的体内外研究

赵亚楠 陈利弘 杨晓龙 董婧颖 吴文兵 陈丹 耿瑞蔓 柯能文 刘戟

引用本文:
Citation:

四硫代钼酸铵抑制铜转运蛋白-1用于胰腺癌治疗的体内外研究

    通讯作者: 刘戟, liuji6103@scu.edu.cn
  • doi: 10.12182/20200960101

Column:  

Inhibition of Copper Transporter-1 by Ammonium Tetrathiocarbolybdate in the Treatment of Pancreatic Cancer

    Corresponding author: LIU Ji, liuji6103@scu.edu.cn
  • 摘要: 目的 检测胰腺癌细胞、原位异种移植的原位胰腺癌小鼠模型和临床胰腺癌组织标本中铜转运蛋白1(copper transporter 1, CTR1)的表达,并验证铜螯合剂四硫代钼酸铵(ammonium tetrathiomolybdate, TM)通过调控胰腺癌细胞中CTR1的表达对胰腺癌的抑制效果。 方法 采用免疫组化法检测22例临床胰腺导管癌及距肿瘤0.5~1 cm的癌旁组织标本中CTR1和抗氧化蛋白1(ATOX1)的表达情况。采用PANC-1细胞构建5只原位胰腺癌裸鼠模型,收集胰腺癌组织中及对应的正常胰腺组织,疫组化法检测CTR1和ATOX1的表达情况,与临床标本进行比较。采用10、30、50、100 μmol/L TM处理人胰腺癌细胞株PANC-1 24 h、48 h、72 h后,使用CCK-8法检测细胞增殖情况;50 μmol/L TM处理PANC-1 24 h、48 h后,划痕实验检测PANC-1细胞侵袭能力变化;10、30、50、100 μmol/L TM处理PANC-1 48 h后,Western blot检测CTR1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和细胞周期蛋白CyclinD1的表达。采用PANC-1细胞建立裸鼠皮下荷瘤模型,分别给予不同剂量TM(0.3 mg/d,1.0 mg/d)灌胃24 d后,观察肿瘤生长情况。 结果 免疫组化结果提示,22例临床胰腺导管癌患者组织标本中,19例(86.36%)出现了CTR1的高表达,且在PANC-1裸鼠原位移植瘤组织中CTR1同样高表达。使用TM处理PANC-1细胞后,细胞增殖抑制程度随着TM剂量的升高、处理时间的延长而逐渐增强;细胞迁移能力下降;胞内CTR1、VEGF和CyclinD1的表达均随着TM剂量的升高而降低。PANC-1荷瘤裸鼠在给予不同剂量TM后,肿瘤生长出现抑制,TM高剂量组的肿瘤体积和肿瘤质量减小更为明显(P<0.05)。 结论 胰腺癌中CTR1表达异常增高,针对这一靶点使用铜螯合剂治疗可能有助于抑制胰腺癌生长迁移。
  • 图 1  免疫组化检测CTR1和ATOX1在临床胰腺癌组织标本中的表达情况(标尺=200 μm)

    Figure 1.  The expression CTR1 and ATOX1 in clinical tissue samplesby IHC (scale bar=200 μm)

    图 2  免疫组化检测CTR1和ATOX1在原位胰腺癌裸鼠模型中的表达情况(标尺=200 μm,白色箭头所指处为PANC-1肿瘤)

    Figure 2.  The expression of CTR1 and ATOX1 proteins in PANC-1 xenografted tumor from nude mice by IHC (scale bar=200 μm. White arrow points out the tumor site)

    图 3  TM对PANC-1细胞增殖的抑制作用(n=3)

    Figure 3.  Inhibitory effect of TMon PANC-1 cell proliferation (n=3)

    图 4  TM对胰腺癌细胞迁移能力的抑制作用(×10,n=3)

    Figure 4.  The inhibitory effect of TM on the migration and invasion of pancreatic cancer cells (×10, n=3)

    图 5  TM对CTR1、VEGF和CyclinD1表达的下调作用(n=3)

    Figure 5.  The down-regulation effect of TM on the expression of CTR1, VEGF and CyclinD1 (n=3)

    图 6  TM对PANC-1裸鼠皮下肿瘤生长的抑制作用(n=4)

    Figure 6.  The inhibitory effect of TM on the subcutaneous tumor growth of PANC-1 nude mice (n=4)

    表 1  TM的稀释

    Table 1.  Dilute the TM

    SolutionFinal concentration/(mmol/L)
    103050100
    Stock solution/μL261020
    PRMI1640/μL98949080
    下载: 导出CSV
  • [1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin,2018,68(1): 7–30. doi: 10.3322/caac.21442
    [2] KLIMCZAK M, DZIKI A, KILANOWICZ A, et al. Concentrations of cadmium and selected essential elements in malignant large intestine tissue. Prz Gastroenterol,2016,11(1): 24–29.
    [3] LENER M R, SCOTT R J, WIECHOWSKA-KOZLOWSKA A, et al. Serum concentrations of selenium and copper in patients diagnosed with pancreatic cancer. Cancer Res Treat,2016,48(3): 1056–1064. doi: 10.4143/crt.2015.282
    [4] ISHIDA S, ANDREUX P, POITRY-YAMATE C, et al. Bioavailable copper modulates oxidative phosphorylation and growth of tumors. Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(48): 19507–19512. doi: 10.1073/pnas.1318431110
    [5] FINNEY L, VOGT S, FUKAI T, et al. Copper and angiogenesis: unravelling a relationship key to cancer progression. Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(1): 88–94. doi: 10.1111/j.1440-1681.2008.04969.x
    [6] GUPTE A, MUMPER R J. Elevated copper and oxidative stress in cancer cells as a target for cancer treatment. Cancer Treat Rev,2009,35(1): 32–46. doi: 10.1016/j.ctrv.2008.07.004
    [7] CHISHOLM C L, WANG H, WONG A H, et al. Ammonium tetrathiomolybdate treatment targets the copper transporter ATP7A and enhances sensitivity of breast cancer to cisplatin. Oncotarget,2016,7(51): 84439–84452. doi: 10.18632/oncotarget.12992
    [8] YU Z, ZHOU R, ZHAO Y, et al. Blockage of SLC31A1-dependent copper absorption increases pancreatic cancer cell autophagy to resist cell death. Cell Prolif, 2019, 52(2): e12568[2020-03-05].https://doi.org/10.1111/cpr.12568.
    [9] KUO M T, FU S, SAVARAJ N, et al. Role of the human high-affinity copper transporter in copper homeostasis regulation and cisplatin sensitivity in cancer chemotherapy. Cancer Res,2012,72(18): 4616–4621. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-0888
    [10] DOS SANTOS N V, MATIAS A C, HIGA G S, et al. Copper uptake in mammary epithelial cells activates cyclins and triggers antioxidant response. Oxid Med Cell Longev, 2015, 2015: 162876[2020-03-05].https://doi.org/10.1155/2015/162876.
    [11] YANG N, YAO N, LIAO X, et al. Effects of metal ions on the structure and activity of a human anti-cyclin D1 single-chain variable fragment AD5. Mol Med Rep,2017,16(2): 1314–1320. doi: 10.3892/mmr.2017.6756
    [12] NARAYANAN G, R B S, VUYYURU H, et al. CTR1 silencing inhibits angiogenesis by limiting copper entry into endothelial cells. PLoS One, 2013, 8(9): e71982[2020-03-05]. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071982.
    [13] LIU X, ZHANG W, WU Z, et al. Copper levels affect targeting of hypoxia-inducible factor 1α to the promoters of hypoxia-regulated genes. J Biol Chem,2018,293(38): 14669–14677. doi: 10.1074/jbc.RA118.001764
    [14] TISATO F, MARZANO C, PORCHIA M, et al. Copper in diseases and treatments, and copper-based anticancer strategies. Med Res Rev,2010,30(4): 708–749. doi: 10.1002/med.20174
    [15] SAFI R, NELSON E R, CHITNENI S K, et al. Copper signaling axis as a target for prostate cancer therapeutics. Cancer Res,2014,74(20): 5819–5831. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-3527
    [16] BARRESI V, TROVATO-SALINARO A, SPAMPINATO G, et al. Transcriptome analysis of copper homeostasis genes reveals coordinated upregulation of SLC31A1,SCO1, and COX11 in colorectal cancer. FEBS Open Bio,2016,6(8): 794–806. doi: 10.1002/2211-5463.12060
    [17] CAI H, PENG F. Knockdown of copper chaperone antioxidant-1 by RNA interference inhibits copper-stimulated proliferation of non-small cell lung carcinoma cells. Oncol Rep,2013,30(1): 269–275. doi: 10.3892/or.2013.2436
    [18] ITOH S, KIM H W, NAKAGAWA O, et al. Novel role of antioxidant-1 (Atox1) as a copper-dependent transcription factor involved in cell proliferation. J Biol Chem,2008,283(14): 9157–9167. doi: 10.1074/jbc.M709463200
    [19] YING H, DEY P, YAO W, et al. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes Dev,2016,30(4): 355–385. doi: 10.1101/gad.275776.115
    [20] BREWER G J, ASKARI F, DICK R B, et al. Treatment of Wilson's disease with tetrathiomolybdate: Ⅴ. Control of free copper by tetrathiomolybdate and a comparison with trientine. Transl Res,2009,154(2): 70–77. doi: 10.1016/j.trsl.2009.05.002
    [21] KHAN G, MERAJVER S. Copper chelation in cancer therapy using tetrathiomolybdate: an evolving paradigm. Expert Opin Investig Drugs,2009,18(4): 541–548. doi: 10.1517/13543780902845622
    [22] CHAN N, WILLIS A, KORNHAUSER N, et al. Influencing the tumor microenvironment: a phase ⅱ study of copper depletion using tetrathiomolybdate in patients with breast cancer at high risk for recurrence and in preclinical models of lung metastases. Clin Cancer Res,2017,23(3): 666–676. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1326
    [23] REDMAN B G, ESPER P, PAN Q, et al. Phase Ⅱ trial of tetrathiomolybdate in patients with advanced kidney cancer. Clin Cancer Res,2003,9(5): 1666–1672.
    [24] JAIN S, COHEN J, WARD M M, et al. Tetrathiomolybdate-associated copper depletion decreases circulating endothelial progenitor cells in women with breast cancer at high risk of relapse. Ann Oncol,2013,24(6): 1491–1498. doi: 10.1093/annonc/mds654
    [25] KIM K K, HAN A, YANO N, et al. Tetrathiomolybdate mediates cisplatin-induced p38 signaling and EGFR degradation and enhances response to cisplatin therapy in gynecologic cancers. Sci Rep, 2015, 5: 15911[2020-03-05].https://www.nature.com/articles/srep15911.doi: 10.1038/srep15911.
    [26] TIAN Y, FANG T, YUAN S, et al. Tetrathiomolybdate inhibits the reaction of cisplatin with human copper chaperone Atox1. Metallomics,2018,10(5): 745–750. doi: 10.1039/C8MT00084K
    [27] BREWER G J. Copper lowering therapy with tetrathiomolybdate as an antiangiogenic strategy in cancer. Curr Cancer Drug Targets,2005,5(3): 195–202. doi: 10.2174/1568009053765807
    [28] SZYMANSKI P, FRACZEK T, MARKOWICZ M, et al. Development of copper based drugs, radiopharmaceuticals and medical materials. Biometals,2012,25(6): 1089–1112. doi: 10.1007/s10534-012-9578-y
    [29] WANG J, LUO C, SHAN C, et al. Inhibition of human copper trafficking by a small molecule significantly attenuates cancer cell proliferation. Nat Chem,2015,7(12): 968–979. doi: 10.1038/nchem.2381
  • [1] 毛兴波盛涛庄丽萍邬长康赵国刚 . 胰腺癌组织miRNA let-7a与HMGA2的表达及血清miRNA let-7a水平对胰腺癌的诊断价值. 四川大学学报(医学版), doi: 10.12182/20200760107
    [2] 张红梅王怡人杨金河冷小红王佩佩李宗显朱彤波 . PKCι对CIK杀伤胰腺癌细胞的影响及作用机制探讨. 四川大学学报(医学版),
    [3] 杜潇程中李旸周总光杨烈张明鸣 . γ分泌酶抑制剂DAPT对胰腺癌细胞生长的影响. 四川大学学报(医学版),
    [4] 魏瑷琳郭强龚姝 . TWEAK/Fn14蛋白在胰腺癌组织中的表达. 四川大学学报(医学版),
    [5] 胡开锋杨秋韵董婧颖等 . 甲基化调控microRNA表达影响胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究. 四川大学学报(医学版),
    [6] 陆颖影曾悦郑俊媛 . MiR-183调控PDCD4表达对SW1990胰腺癌细胞生长的调节作用. 四川大学学报(医学版),
    [7] 陈巍巍郭强张肇达等 . 晚期糖基化终末产物受体在胰腺癌细胞增殖及 成瘤过程中的作用. 四川大学学报(医学版),
    [8] 董慧明黄健康龚晓萌等 . MACC1、Snail和KISS-1蛋白在浸润性乳腺癌中的表达及其临床病理意义. 四川大学学报(医学版),
    [9] 黄学东王霞刘颖等 . 1例肾病综合征并发急性胰腺炎伴腹水的毛细管血清蛋白电泳特征图谱分析. 四川大学学报(医学版),
    [10] 周牮古龙彭建华庞金伟谢雨珂郭科成张丽芳张先辉陈礼刚江涌 . 小鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤期转运蛋白的表达. 四川大学学报(医学版),
    [11] 马晓菊贾红周艾婧等 . 凉山地区HUA患病与尿酸转运蛋白相关基因单核苷酸多态性的关联性研究. 四川大学学报(医学版),
    [12] 陈瑶张中伟王波尹万红左艳艳康焰刘进 . 早期血浆白蛋白变异对ICU重症急性胰腺炎患者预后评估的价值. 四川大学学报(医学版),
    [13] 潘秀懿谭珺娅聂玲等 . 前列腺癌ERG 基因重排与蛋白表达及其与预后的关系. 四川大学学报(医学版),
    [14] 邹丹刘勇肖桂荣等 . 消退素RvD1抑制LPS诱导的大鼠胰腺腺泡细胞炎性反应的实验研究. 四川大学学报(医学版),
    [15] 赵艳金鑫李楠等 . ALDH1、Twist在胃腺癌组织中的表达及临床意义. 四川大学学报(医学版),
    [16] 李星斓陈雪芹聂玲徐苗李秋尧商维维陈铌黄蕤曾浩周桥 . 抗凋亡基因Bfl-1在前列腺癌中的表达及作用<. 四川大学学报(医学版),
    [17] 叶丹王凤英刘祚燕等 . 消退素RvD1减轻雨蛙素联合LPS诱导的小鼠重症急性胰腺炎的实验研究. 四川大学学报(医学版),
    [18] 周蕾武世伍俞岚等 . 胃腺癌组织KAI1的表达及与血管、淋巴管生成的关系. 四川大学学报(医学版),
    [19] 赵静张立涛白云王泽阳张雪梅马春玲 . 抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1表达对乳腺癌细胞增殖和周期的影响. 四川大学学报(医学版),
    [20] 蒋素芳屠凯岭周兰等 . Heregulin-β1诱导的糖酵解对乳腺癌细胞MCF7迁移的影响. 四川大学学报(医学版),
  • 加载中
图(6) / 表(1)
计量
  • 文章访问数:  217
  • HTML全文浏览量:  121
  • PDF下载量:  5
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-04-08
  • 录用日期:  2020-06-01
  • 网络出版日期:  2020-07-06

四硫代钼酸铵抑制铜转运蛋白-1用于胰腺癌治疗的体内外研究

    通讯作者: 刘戟, liuji6103@scu.edu.cn
  • 1. 四川大学华西基础医学与法医学院 生物化学与分子生物学教研室 (成都 610041)
  • 2. 四川大学华西医院 胰腺外科 (成都 610041)

摘要:  目的 检测胰腺癌细胞、原位异种移植的原位胰腺癌小鼠模型和临床胰腺癌组织标本中铜转运蛋白1(copper transporter 1, CTR1)的表达,并验证铜螯合剂四硫代钼酸铵(ammonium tetrathiomolybdate, TM)通过调控胰腺癌细胞中CTR1的表达对胰腺癌的抑制效果。 方法 采用免疫组化法检测22例临床胰腺导管癌及距肿瘤0.5~1 cm的癌旁组织标本中CTR1和抗氧化蛋白1(ATOX1)的表达情况。采用PANC-1细胞构建5只原位胰腺癌裸鼠模型,收集胰腺癌组织中及对应的正常胰腺组织,疫组化法检测CTR1和ATOX1的表达情况,与临床标本进行比较。采用10、30、50、100 μmol/L TM处理人胰腺癌细胞株PANC-1 24 h、48 h、72 h后,使用CCK-8法检测细胞增殖情况;50 μmol/L TM处理PANC-1 24 h、48 h后,划痕实验检测PANC-1细胞侵袭能力变化;10、30、50、100 μmol/L TM处理PANC-1 48 h后,Western blot检测CTR1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和细胞周期蛋白CyclinD1的表达。采用PANC-1细胞建立裸鼠皮下荷瘤模型,分别给予不同剂量TM(0.3 mg/d,1.0 mg/d)灌胃24 d后,观察肿瘤生长情况。 结果 免疫组化结果提示,22例临床胰腺导管癌患者组织标本中,19例(86.36%)出现了CTR1的高表达,且在PANC-1裸鼠原位移植瘤组织中CTR1同样高表达。使用TM处理PANC-1细胞后,细胞增殖抑制程度随着TM剂量的升高、处理时间的延长而逐渐增强;细胞迁移能力下降;胞内CTR1、VEGF和CyclinD1的表达均随着TM剂量的升高而降低。PANC-1荷瘤裸鼠在给予不同剂量TM后,肿瘤生长出现抑制,TM高剂量组的肿瘤体积和肿瘤质量减小更为明显(P<0.05)。 结论 胰腺癌中CTR1表达异常增高,针对这一靶点使用铜螯合剂治疗可能有助于抑制胰腺癌生长迁移。

English Abstract

Column:  

  • 胰腺癌是目前致死率最高的恶性肿瘤之一,其肿瘤发生发展机制尚不明确,超过80%的患者在就诊时已发现远处转移或侵犯重要血管,其患者5年生存率不足5%[1]。探明胰腺癌发病过程中的具体发展机制,对胰腺癌的预防和治疗具有重要意义。

    恶性肿瘤的发生发展中,除了葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、蛋白质合成等的改变外,有研究者发现,肿瘤的发生发展也与部分微量元素代谢的改变有关[2-3]。铜是人体正常生理需要的一种微量金属元素,在生长发育、免疫反应和伤口修复过程中起着重要作用[4-6]。有研究陆续发现,多种肿瘤组织中均存在铜代谢异常的现象,而过度丰富的铜离子可能与促进癌细胞增殖、肿瘤血管生成、侵袭和迁移有关[2, 4-5],针对这一现象,使用铜螯合剂实施降铜疗法,可能对这些肿瘤有一定治疗效果。肿瘤铜代谢异常通常与一系列铜代谢相关蛋白的过表达有关,如铜转运蛋白1 (copper transporter 1,CTR1)、抗氧化蛋白1(antioxidant protein1,ATOX1)、超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白(copper chaperone for superoxide dismutas,CCS)、细胞色素氧化酶17(cytochrome oxidase17,COX17)等。其中,位于细胞膜表面的CTR1是真核生物细胞中最重要的铜离子跨膜转运分子,目前已在肝细胞癌、前列腺癌和卵巢癌等多种肿瘤组织中发现CTR1表达水平异常升高[7-9]。有临床研究结果显示,胰腺癌患者的血液样本中也存在异常升高的铜离子水平,这提示在胰腺癌的发生发展过程中,可能同样存在铜代谢及CTR1等相关蛋白的异常,而降铜疗法可能对胰腺癌的防治也具有一定效果。

    四硫代钼酸铵(ammonium tetrathiomolybdate, TM)是一种高亲和力的铜络合物,并且具有出色的安全性,它通过与血清白蛋白和铜离子形成稳定的三方复合物,使复合的铜离子无法被细胞摄取。既往研究显示CTR1的改变会影响铜离子的摄取,进而影响下游肿瘤相关血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与细胞周期蛋白CyclinD1的表达[10-13]。为了探究胰腺癌与CTR1的关系以及TM对CTR1及胰腺癌发生发展的影响,本研究中,我们收集胰腺癌患者肿瘤组织标本和原位胰腺癌小鼠模型的PANC-1肿瘤组织,探索TM对胰腺癌中CTR1的表达影响和抗肿瘤作用。现报道如下。

    • TM购自Sigma-Aldrich。称取0.13 g TM溶于1 mL二甲基亚砜(DMSO),充分溶解混匀,配制成500 mmol/L的母液备用。使用时先用PBS缓冲液将母液稀释(表1),再将表中溶液用培养基稀释1 000倍即可。0 μmol/L TM即DMSO对照孔加入与最大TM浓度孔等量的DMSO,避免DMSO增大误差。

      表 1  TM的稀释

      Table 1.  Dilute the TM

      SolutionFinal concentration/(mmol/L)
      103050100
      Stock solution/μL261020
      PRMI1640/μL98949080
    • 本研究获得了四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会的伦理许可(2015年审267号),符合《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的伦理标准。收集2018年6月1日−12月30日于四川大学华西医院胰腺外科进行R0切除手术的22例胰腺导管癌患者的肿瘤组织及距肿瘤0.5~1 cm的癌旁组织标本,于液氮中保存,并用于后续免疫组化检测。临床组织标本用体积分数10%甲醛缓冲液固定,石蜡包埋后制作5 μm组织切片,使用抗CTR1(美国Novus,1∶100)和抗ATOX1(美国Novus,1∶100)抗体分别进行DAB免疫组化检测,阳性染色为棕黄色,根据棕黄色染色细胞比例分为4个分数等级。1分:0~25%染色;2分:26%~50%染色;3分:51%~75%染色;4分:>75%染色。本研究将分数≥2的标本定为阳性。

    • 本实验所用人胰腺癌细胞株PANC-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞株用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基,于37 ℃、体积分数为5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养,待贴壁率超过80%时,使用0.25%(V/V)猪胰蛋白酶对细胞进行消化传代。

    • CCK-8法检测TM处理后细胞增殖变化。将PANC-1细胞以1.0×104个/孔的密度接种于96孔板培养过夜。更换为含TM的新鲜培养基,使其终浓度为0(DMSO)、10、30、50、100 μmol/L,每组设3个平行复孔,于培养0 h、24 h、48 h、72 h时检测细胞增殖情况:每孔加入CCK8试剂(日本同仁化工)10 μL,于培养箱中孵育3 h后,取出96孔板置于酶标仪(美国Bio-Rad)中,设置波长为450 nm,测定每孔的吸光度(A),以时间为横坐标,A值为纵坐标,绘制细胞增殖曲线。

    • PANC-1细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板培养过夜贴壁。使用10 μL无菌枪头对孔板中心位置均匀划线,分为两组,实验组孔中加入终浓度为50 μmol/L的TM,对照组孔加入与实验组等量的DMSO,持续培养细胞,并分别于加药后0 h、24 h、48 h在倒置显微镜下观察记录细胞划痕宽度与细胞迁移情况,使用ImageJ软件计算划痕愈合率,愈合率(%)=(0 h划痕宽度-t h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

    • PANC-1细胞以2.5×107/mL的密度接种于6孔板中培养过夜贴壁,经0(DMSO)、10、30、50、100 μmol/L TM处理48 h后,用预冷的PBS将细胞洗涤3遍,将RIPA裂解液与PMSF以100∶1的体积比混合均匀,6孔板每孔加入100 μL混合液,使用细胞刮刀刮取细胞,于4 ℃冰箱静置30 min,使细胞充分裂解,4 ℃冷冻离心机中,12 000 r/min离心15 min,收集上清备用,使用BCA法测定蛋白浓度(北京碧云天)。12%SDS-PAGE胶进行电泳,每孔上样40 μg蛋白,电泳完毕后将蛋白湿转至硝酸纤维素膜,使用含5%脱脂牛奶的0.5%TBST室温封闭1 h,分别用β-actin (Proteintech,美国)、CTR1 (Novus,美国)、VEGF(Cell Signaling Technology,美国)、CyclinD1(Cell Signaling Technology,美国)一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗涤3次,每次10 min,二抗室温孵育1 h,TBST洗涤3次,每次10 min,使用ECL化学发光试剂盒显色成像,用Image J软件分析蛋白条带的灰度。以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

    • 本研究动物实验获四川大学动物保护与使用委员会许可,实验过程遵循我国《实验动物福利伦理审查指南(GB/T 35892 2018)》提出的原则与要求。实验所用裸鼠购自成都达硕实验动物公司。

    • 构建原位胰腺癌裸鼠模型与临床胰腺癌和癌旁组织标本做对照,探究胰腺癌和癌旁组织中铜转运蛋白表达情况。采用手术注射法构建5只原位胰腺癌裸鼠模型,在左上腹直肠旁线处行约1 cm的纵行切口,小心分离脾脏,暴露胰腺,将20 μL细胞悬液(约1×106个PANC-1细胞)注射至胰腺被膜下,6周后处死裸鼠,收集肿瘤组织及对应的正常胰腺组织用于后续免疫组化检测CTR1及ATOX1的表达(定性分析)。

    • 构建皮下移植瘤裸鼠模型观察给药治疗后肿瘤大小变化,探究TM在体内对胰腺癌肿瘤生长的影响。将100 μL PANC-1细胞悬液(约5×106个细胞)接种于裸鼠右腋下构建PANC-1皮下移植瘤裸鼠模型。接种8 d后,随机将实验动物分为3组,每组4只,开始灌胃给药治疗。TM低剂量组:0.3 mg/d,约0.1 mL,隔天给药,共给药4次;TM高剂量组:1.0 mg/d,约0.1 mL,隔天给药,共给药4次;对照组灌胃等体积PBS。每2 d使用游标卡尺测量肿瘤长短径,观察并记录肿瘤生长情况,肿瘤体积=长×宽×宽/2,长和宽的单位均为mm。首次给药24 d后,处死动物,剥离各组肿瘤瘤体,分别进行称重记录。

    • 所有实验独立重复3次或至少3个复孔,实验数据用$ \bar x \pm s $表示。组间两两比较用配对样本t检验,多组间比较用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

    • CTR1蛋白表达一般定位于细胞膜与细胞质,ATOX1蛋白表达一般定位于细胞质。如图1所示,22例胰腺导管癌患者的组织标本中,19例患者肿瘤组织CTR1阳性表达,而仅有5例患者肿瘤组织中ATOX1阳性表达,癌旁组织均显示低表达,提示在大部分胰腺癌肿瘤组织中,CTR1表达水平异常升高。PANC-1原位胰腺癌裸鼠模型的肿瘤组织中同样显示CTR1高表达,而ATOX1的表达相对较低,癌旁组织均显示低表达(图2)。上述结果表明,胰腺癌中铜转运蛋白CTR1异常高表达,而ATOX1的相对改变较小。

      图  1  免疫组化检测CTR1和ATOX1在临床胰腺癌组织标本中的表达情况(标尺=200 μm)

      Figure 1.  The expression CTR1 and ATOX1 in clinical tissue samplesby IHC (scale bar=200 μm)

      图  2  免疫组化检测CTR1和ATOX1在原位胰腺癌裸鼠模型中的表达情况(标尺=200 μm,白色箭头所指处为PANC-1肿瘤)

      Figure 2.  The expression of CTR1 and ATOX1 proteins in PANC-1 xenografted tumor from nude mice by IHC (scale bar=200 μm. White arrow points out the tumor site)

    • CCK8结果显示(图3),经TM处理后72 h内,人胰腺癌细胞PANC-1的增殖速率受到了抑制,且受抑制程度呈现出时间和TM剂量依赖性,即时间越长或TM剂量越大,细胞增殖抑制程度越明显。100 μmol/L TM处理24 h后,细胞受抑制进入平台期,后续不再明显生长。

      图  3  TM对PANC-1细胞增殖的抑制作用(n=3)

      Figure 3.  Inhibitory effect of TMon PANC-1 cell proliferation (n=3)

    • 细胞划痕实验结果(图4)显示,在24 h和48 h后,TM处理组(50 μmol/L)的划痕愈合率与对照组相比降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

      图  4  TM对胰腺癌细胞迁移能力的抑制作用(×10,n=3)

      Figure 4.  The inhibitory effect of TM on the migration and invasion of pancreatic cancer cells (×10, n=3)

    • Western blot结果显示(图5),TM处理48 h后PANC-1细胞内的CTR1表达随TM的剂量升高逐渐降低,与DMSO组比较,差异有统计学意义(P<0.01),提示TM处理可抑制细胞内CTR1的表达;除50 μmol/L TM 组与100 μmol/L TM组间CTR1表达差异无统计学意义外,余浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.05) 。在TM处理后,随着CTR1的表达降低,VEGF与CyclinD1的表达亦下降:VEGF表达,10 μmol/L TM组与其余TM浓度组比较差异均有统计学意义(P<0.01);CyclinD1表达,10 μmol/L TM组与50、100 μmol/L TM组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

      图  5  TM对CTR1、VEGF和CyclinD1表达的下调作用(n=3)

      Figure 5.  The down-regulation effect of TM on the expression of CTR1, VEGF and CyclinD1 (n=3)

    • 结果见图6。TM对PANC-1胰腺癌肿瘤表现出一定的生长抑制作用,且高剂量组的肿瘤抑制效果更明显:给药24 d后,TM低剂量组和TM高剂量组肿瘤体积和肿瘤质量均小于对照组(P<0.05);TM高剂量组的肿瘤体积和肿瘤质量减小更为明显(P<0.05)。高剂量组的实验动物中,有2只在实验结束时出现了较为明显的体质量下降(体质量下降>10%)。

      图  6  TM对PANC-1裸鼠皮下肿瘤生长的抑制作用(n=4)

      Figure 6.  The inhibitory effect of TM on the subcutaneous tumor growth of PANC-1 nude mice (n=4)

    • 肿瘤细胞的增殖与肿瘤相关血管生长都需要铜离子的参与,大量临床证据证实,多种恶性肿瘤的发生发展过程中都出现了铜代谢异常[2, 5, 14]。铜的代谢和体内分布受到多种转运蛋白和细胞内分子伴侣网络的严格调控,其中CTR1是一种高亲和力的跨膜铜转运蛋白,能有效将铜离子由胞外转运至胞内,并在后续ATOX1、CCS、COX-17、ATP7A、ATP7B等分子的参与作用下,启动一系列铜相关生理功能。既往研究显示CTR1在肝癌、前列腺癌和卵巢癌的肿瘤组织中均出现了高表达的现象[15-16],而ATOX1则是调控乳腺癌和非小细胞肺癌化疗效果的关键靶点[17-18],针对这两个靶点开展基因或药物治疗能有效抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长。

      有临床研究显示,在胰腺癌患者的血液样本中也发现了较高的铜离子水平[3, 19],因此,我们推测胰腺癌中也可能存在铜代谢异常并与CTR1和ATOX1等铜转运分子相关。为了证实这一推测,我们首先用免疫组化法检测了临床胰腺癌患者及原位异种移植的胰腺癌小鼠模型的肿瘤组织及癌旁组织标本中铜代谢相关的两个关键分子:CTR1与ATOX1。与已证实的部分肿瘤相似,CTR1在胰腺癌中同样存在异常高表达现象;而ATOX1在胰腺癌组织中的表达改变与CTR1相比则较弱,这一结果提示我们,相较于ATOX1,CTR1可能是更为适合胰腺癌机制和防治研究的潜在靶点。

      TM是一种铜螯合剂,具有良好的铜螯和能力,可阻断细胞对铜离子的摄取,调节血清中铜离子的水平,临床曾用来治疗威尔逊氏症,后续有研究证实该药物还可有效抑制乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌细胞的增殖,增强上述肿瘤对顺铂的敏感性,降低化疗期间的耐药性[20-26]。既往抗肿瘤研究中,在确定铜代谢异常的基础上,人们尝试使用四硫钼酸盐等铜螯合剂实施降铜疗法,可有效抑制部分肿瘤细胞增殖[27-29]。基于CTR1在胰腺癌中异常高表达的现象,我们推测降铜疗法可能对胰腺癌的治疗也同样有效。在本研究中,我们对TM的体内外抗胰腺癌效果和治疗机制进行了初步研究。在体外细胞实验中用不同浓度的TM处理胰腺癌细胞后,CCK8及细胞划痕实验检测细胞的增殖和迁移能力,Western blot检测细胞中CTR1及下游肿瘤细胞增殖和血管生成关键蛋白的表达情况;结果显示TM处理可下调CTR1、VEGF以及CyclinD1的表达,抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。体内实验结果也同样证实了TM对PANC-1胰腺癌肿瘤的生长有抑制效果,但过高浓度的TM治疗可能引发血清铜水平过低的相关疾病,因此还需要进一步摸索治疗剂量与方法。由于时间所限,本研究未能对铜代谢通路中更多的转运蛋白和分子伴侣进行检测,也未能对胰腺癌中CTR1下游的相关调控通路与机制进行深入探讨,将留待课题组成员后续开展进一步研究。

      本研究结果提示,胰腺癌的发生发展与铜代谢分子CTR1的异常表达有关,TM降铜疗法可通过下调CTR1的表达抑制肿瘤的发生发展,为胰腺癌的防治提供新的靶点和治疗策略。

参考文献 (29)

目录

    /

    返回文章
    返回