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纳米二氧化硅通过PI3K/AKt信号通路影响肺泡巨噬细胞凋亡的研究

李宁 陈祥娃 霍婷婷 董发勤 邓建军

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栏目: 论 著

纳米二氧化硅通过PI3K/AKt信号通路影响肺泡巨噬细胞凋亡的研究

    通讯作者: 邓建军, jianjundeng0801@163.com
  • doi: 10.12182/20200760103

Column:  

Nano-silicon Dioxide Affects Apoptosis of Alveolar Macrophages via PI3K/AKt Signaling Pathway

    Corresponding author: DENG Jian-jun, jianjundeng0801@163.com
  • 摘要: 目的 探讨磷脂酰肌醇激酶-3/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKt)信号通路对纳米二氧化硅(nano silica,NS)粉尘诱导肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)凋亡发生的影响。 方法 通过不同质量浓度的NS粉尘染毒AM细胞后,CCK-8法检测细胞存活率;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞的凋亡率与线粒体膜电位;Western blot法检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及磷酸化(p)-PI3K、p-AKt的表达水平。 结果 NS可降低AM细胞的存活率,部分细胞出现凋亡形态学改变;LY294002预处理AM后,线粒体膜电位水平的下降程度增加,并下调Bcl-2、p-PI3K、p-AKt蛋白的表达,同时上调Bax蛋白的表达,增加细胞凋亡率。 结论 PI3K/AKt信号通路可能参与了NS诱导AM细胞的凋亡过程。
  • 图 1  不同质量浓度NS对AM存活率影响(n=3)

    Figure 1.  The effect of NS on the survival rate of AM (n=3)

    a P<0.01, vs. control group (0 μg/mL NS); b P<0.05, c P<0.01, vs. 12 h group; * P<0.05, vs. 24 h

    图 2  荧光显微镜观察NS染毒AM凋亡形态。 ×400

    Figure 2.  Cellular morphology of apoptotic AM induced by NS under fluorescence microscopy. ×400

    A: Control group (0 μg/mL NS); B: 5 μg/mL NS group; C: 10 μg/mL NS group. White arrows indicated apoptotic cells

    图 3  LY294002预处理后NS染毒24 h对AM凋亡率的影响(n=3)

    Figure 3.  The apoptotic rates of AM after 24 h exposure to NS pretreated by LY294002 (n=3)

    ** P<0.01, vs. control group (0 μg/mL NS); ## P<0.01; * P<0.05

    图 4  LY294002预处理后NS染毒24 h对AM线粒体膜电位的影响(n=3)

    Figure 4.  The mitochondrial membrane potential of AM after 24 h exposure to NS pretreated by LY294002 (n=3)

    A: LY294002-; B: LY294002+; C: Bar graphs representing the proportion of mitochondrial membrane potential (n=3); a: Control (0 μg/mL NS); b: 5 μg/mL NS; c: 10 μg/mL NS. ** P<0.01, vs. control group (0 μg/mL NS); ## P<0.01; * P<0.01

    图 5  NS和LY294002对凋亡相关蛋白表达的影响(n=3)

    Figure 5.  The effect of NS and LY294002 on the expressions of apoptosis related proteins (n=3)

    ** P<0.01, vs. control group (0 μg/mL NS); # P<0.05; ## P<0.01

    图 6  NS和LY294002处理后AM凋亡相关蛋白表达水平

    Figure 6.  The levels of apoptosis related proteins in AM after treatment with NS and LY294002

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-16
  • 录用日期:  2020-02-12
  • 网络出版日期:  2020-07-21
  • 刊出日期:  2020-07-01

栏目: 论 著

纳米二氧化硅通过PI3K/AKt信号通路影响肺泡巨噬细胞凋亡的研究

    通讯作者: 邓建军, jianjundeng0801@163.com
  • 1. 西南医科大学附属医院 医学检验部 (泸州 646000)
  • 2. 四川省妇幼保健院 检验科 (成都 610041)
  • 3. 西南科技大学 固体废物处理与资源化教育部重点实验室 (绵阳 621010)
  • 4. 四川绵阳四〇四医院 检验科 (绵阳 621000)

摘要:  目的 探讨磷脂酰肌醇激酶-3/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKt)信号通路对纳米二氧化硅(nano silica,NS)粉尘诱导肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)凋亡发生的影响。 方法 通过不同质量浓度的NS粉尘染毒AM细胞后,CCK-8法检测细胞存活率;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞的凋亡率与线粒体膜电位;Western blot法检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及磷酸化(p)-PI3K、p-AKt的表达水平。 结果 NS可降低AM细胞的存活率,部分细胞出现凋亡形态学改变;LY294002预处理AM后,线粒体膜电位水平的下降程度增加,并下调Bcl-2、p-PI3K、p-AKt蛋白的表达,同时上调Bax蛋白的表达,增加细胞凋亡率。 结论 PI3K/AKt信号通路可能参与了NS诱导AM细胞的凋亡过程。

English Abstract

Column:  

  • 纳米二氧化硅(nano-silica, NS)是一种粒径极小、表面效应较强、结构稳定性和易散性极佳的二氧化硅(SiO2)超微颗粒[1],在人们的日常生活、科研、城市化建设及工业化发展等领域发挥着重要的用途,但也加大了人群暴露NS的风险。研究证实[2-3],NS粉尘是大气细颗粒物的关键组成成分,与前几年的雾霾天气密切相关。在实验中还发现NS对机体的毒性远远大于SiO2[4],流行病学资料也表明[5]长期呼吸含NS粉尘的空气可导致机体矽肺、肺部炎症、肺纤维化及肺癌等发病率上升,其致病机制可能与NS粉尘随呼吸进入肺泡组织、诱发肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AM)发生凋亡事件相关。细胞凋亡是AM吞噬和清除肺内颗粒物和病原微生物等,保护机体不受侵害的重要靶向环节之一[6-7]。而细胞凋亡调控受多种凋亡信号传导通路共同制约,其中磷脂酰肌醇激酶-3/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKt)通路与细胞凋亡密切相关[8-9]。文献已报道调控 PI3K/AKt信号通路可以诱导肺癌[10]、肝癌[11]、白血病[12]等肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤。另有研究[13]也指出在NS所致肺纤维化过程中PI3K/AKt通路有一定表达,但是PI3K/AKt信号通路是如何参与NS粉尘致AM凋亡的作用机制目前尚不清楚。因此,本研究选用NS体外染毒AM,通过加入PI3K抑制剂LY294002,观察细胞凋亡率与线粒体膜电位、以及凋亡相关蛋白表达的变化,探讨NS粉尘致AM凋亡发生的分子调控机制,为NS粉尘造成的细胞毒性机制提供新的理论依据。

    • 主要试剂:改良型F12K培养基(Hyclone公司);胎牛血清(Gibco公司);DMSO(四川生科力);CCK-8细胞计数试剂盒、青霉素-链霉素双抗溶液、Hoechst33342染液、PI3K抑制剂LY294002(粉末状,纯度大于98%,用DMSO配制溶解)、胰蛋白酶消化液(上海碧云天);Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基);抗兔磷酸化(p)-PI3K抗体、抗兔p-AKt抗体、抗兔GAPDH抗体(美国 CST);抗兔Bcl-2抗体、抗兔Bax抗体(英国 Abcam)。

      主要仪器:倒置相差荧光显微镜(Axio Observer A, Zeiss公司),微孔板分光光度计(BioTek Power Wave XS2, BioTek公司),流式细胞仪(FACS Calibur, Becton Dickinson公司),蛋白电泳仪(164-5051, BIO-RAD公司),凝胶成像系统(BOXChemiXR5, SYNGENE公司)。

    • AM选用大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383细胞株,购于中国科学院上海生命科学研究院),培养于含150 mL/L胎牛血清、10 mL/L青-链霉素双抗溶液(含100 μg /mL链霉素+100 U/mL 青霉素)的F12K完全培养基中,置于pH 值为7. 2~7. 4、温度37 ℃、饱和湿度环境、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养,每2 d 按1∶2的比例进行常规消化和传代,选取对数期生长良好的细胞,进行后续实验。

      NS粉尘(粒径为30 nm)购于北京德科岛金科技有限公司。实验前,称量NS粉尘,置160 ℃烘箱烘烤2 h后,用F12K基础培养基配制成1 000 μg /mL的母液,密封,超声振荡仪振荡混匀20 min,母液呈清亮透明状态,置4 ℃冰箱保存备用。实验中所有NS粉尘悬液均须用F12K基础培养基稀释。

    • 用F12K完全培养基调整对数生长期AM,使细胞密度为1×105 mL-1。选取3块无菌96孔培养板,每孔接种150 μL细胞悬液孵育24 h。每块培养板设置空白组(实验过程中只加F12K基础培养基)、实验组(实验过程中加相应的用F12K基础培养基配置的NS粉尘悬液和AM悬液)和对照组(实验过程中只加相应的用F12K基础培养基配置的NS粉尘悬液)。待细胞贴壁生长融合达到80%,弃上清,PBS清洗2次,依次加入5、10、20、40、60、80、100 μg/mL NS粉尘悬液(同浓度设置3平行孔),孵育12 h、24 h 和48 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,避光孵育1.5 h,微孔板分光光度计测量450 nm波长处吸光度(A) 值。计算细胞相对存活率〔(A实验组−A空白孔) /(A对照组−A空白孔)× 100% 〕,绘制生长曲线。

    • 实验设置空白对照组和NS粉尘(5、10 μg/mL)组。选取对数生长期的AM(密度为1×105 mL-1),每孔接种2 mL细胞悬液到6孔板中,孵育24 h;待细胞贴壁至80%时,弃上清,PBS洗涤2次,加入2 mL质量浓度为0(空白对照组)、5、10 μg/mL NS粉尘悬液染毒AM 24 h;PBS洗涤2次,加入1 mL体积分数为70%乙醇(4 ℃保存)静置固定细胞10~20 min;PBS洗涤2次,每孔加入1 mL Hoechst33342染液(10 μg/mL),室温避光孵育10 min,吸除含染料的培养液,PBS洗涤2次,每孔加入适量的抗荧光猝灭封片液,并用洁净的盖玻片覆盖,荧光显微镜下观察AM形态。

    • 实验分为NS粉尘(0、5、10 μg/mL)组和抑制剂LY294002+NS粉尘(0、5、10 μg/mL)组(抑制剂组)。选取对数生长期的AM,调整细胞密度1×105 mL-1,每孔接种2 mL细胞悬液到6孔板,孵育24 h;待细胞贴壁生长融合至80%时,抑制剂组提前加入2 mL浓度为20 μmol/L的LY294002预处理AM 2 h,再向各组加入2 mL不同质量浓度的NS粉尘悬液共同孵育AM 24 h后,消化、离心收集AM。使用Binding Buffer悬浮细胞后,分别加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和PI染液,室温避光孵育5~15 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验组的每个质量浓度设3个平行孔。

    • 实验分组同1.3.3。收集各组NS粉尘染毒24 h后的AM,加入10 μmol/L JC-1工作液500 μL悬浮细胞,孵育15~20 min,2 000 r/min离心5 min收集细胞,用1×Incubation Buffer洗涤2次;加入500 μL 1×Incubation Buffer重新悬浮细胞;JC-1标记后,用流式细胞仪检测细胞凋亡时发出的绿色荧光强度(位于流式细胞仪的检测图谱坐标轴右下象限区域细胞百分比率),反映细胞线粒体膜电位下降程度,实验组的每个质量浓度设3 个平行孔。

    • 实验分组同1.3.3。收集各组NS粉尘染毒24 h后的AM,每孔加入200 μL细胞裂解液提取每组细胞总蛋白,并检测各组蛋白的含量。SDS-PAGE分离后转PVDF膜,50 mL/L脱脂奶粉封闭1.5~2 h,加入抗兔p-AKt抗体(1∶1 000)、抗 兔p-PI3K抗体(1∶1 000)、抗兔Bcl-2抗体(1∶2 000)、抗兔Bax抗体(1∶2 000)、抗兔GAPDH抗体(1∶1 000)震荡孵育过夜,TBST洗膜3次,加入1∶5 000稀释的HRP 标记的羊抗兔IgG,孵育1~2 h;TBST洗膜3次,漂洗,吸干,显色,运用凝胶成像处理系统检测分析处理,目的蛋白条带灰度值与内参蛋白GAPDH条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

    • 样本数据以$\overline x $±s表示。在数据满足正态分布且方差齐的前提下,组间样本均数的比较采用单因素方差分析,否则采用校正t检验(t’检验),P<0.05为差异有统计学意义。

    • 图1所示,不同质量浓度NS染毒AM 12 h、24 h和48 h后,与对照组相比,细胞存活率随着NS染毒质量浓度增加和染毒时间延长均呈递减趋势,且存在时间-剂量依赖效应(P<0.05);当NS质量浓度为80 μg/mL时,12 h和24 h组间细胞存活率的差异无统计学意义;AM在NS质量浓度为5、10 μg/mL时,染毒12 h、24 h、48 h后,细胞存活率均超过50%,因此将其选为后续实验的染毒终浓度。

      图  1  不同质量浓度NS对AM存活率影响(n=3)

      Figure 1.  The effect of NS on the survival rate of AM (n=3)

    • 图2所示,空白对照组(A)AM呈均匀浅蓝色荧光,细胞形态较为规则,细胞核呈椭圆形或圆形,且胞核相对规则;AM经NS粉尘染毒后,5 μg/mL NS粉尘组(B)部分细胞染色质浓染聚集到细胞一侧呈亮蓝色的强荧光表象,与细胞质荧光强度有明显差异,且该细胞相对周围细胞体积变小、形态欠规则、胞核偶见波纹状或折叠样改变;10 μg/mL NS粉尘组(C)镜下可查见凋亡小体,部分亮蓝色强荧光表象的细胞有明显的核固缩或核碎裂等凋亡样改变,核膜不完整,细胞体积大小不均一。

      图  2  荧光显微镜观察NS染毒AM凋亡形态。 ×400

      Figure 2.  Cellular morphology of apoptotic AM induced by NS under fluorescence microscopy. ×400

    • 图3所示,AM染毒24 h后,细胞凋亡率随着NS质量浓度增加而上升,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);LY294002预处理后,5、10 μg/mL NS组AM凋亡率分别为35.57%±0.60%、39.60%±1.24%,与同质量浓度未使用抑制剂组相比,细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.01)。

      图  3  LY294002预处理后NS染毒24 h对AM凋亡率的影响(n=3)

      Figure 3.  The apoptotic rates of AM after 24 h exposure to NS pretreated by LY294002 (n=3)

    • 图4所示,未经LY294002处理的NS组,绿色荧光强度百分比随着NS质量浓度增高呈上升趋势,差异有统计学意义(P<0.01);LY294002处理后,在5、10 μg/mL NS染毒AM后,绿色荧光强度百分比分别较相同质量浓度的未经LY294002处理的NS组增加4.89%和10.10%( P<0.01),提示线粒体膜电位下降更为明显。

      图  4  LY294002预处理后NS染毒24 h对AM线粒体膜电位的影响(n=3)

      Figure 4.  The mitochondrial membrane potential of AM after 24 h exposure to NS pretreated by LY294002 (n=3)

    • Western blot检测结果见图5图6,所有蛋白均经内参蛋白GAPDH校正。不同质量浓度NS染毒AM 24 h后,与对照组比较,Bcl-2、p-PI3K、p-AKt蛋白表达水平下降,而Bax表达升高,差异均有统计学意义(P<0.01);相同质量浓度的NS染毒组,使用LY294002预处理后,Bcl-2、p-PI3K、p-AKt蛋白表达降低,Bax蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

      图  5  NS和LY294002对凋亡相关蛋白表达的影响(n=3)

      Figure 5.  The effect of NS and LY294002 on the expressions of apoptosis related proteins (n=3)

      图  6  NS和LY294002处理后AM凋亡相关蛋白表达水平

      Figure 6.  The levels of apoptosis related proteins in AM after treatment with NS and LY294002

    • NS是我国及世界工业化产量最高的一种纳米材料,目前,已有大约2 000种含NS颗粒的产品进入市场[14]。人体可通过多种方式接触NS粉尘,如呼吸含NS的空气、使用含NS的化妆品、口服含NS颗粒的药物等。流行病学调查发现,长期接触NS颗粒可导致人群的呼吸系统疾病发病率和死亡率升高[15]。因此,NS对机体潜在的毒性影响需引起人们的高度重视。

      随呼吸系统进入肺泡组织的 NS 可导致 AM 凋亡发生,进而引起呼吸、心血管、肾脏多系统毒性。NS 作用 AM一方面可通过提高 AM 内活性氧表达水平,激活线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡发生[16];另一方面SiO2刺激巨噬细胞分泌的高浓度肿瘤坏死因子和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8,可启动死亡受体结构域的聚集促进凋亡发生[17]。另有文献也报道[18],NS 可通过激活 p53,提高细胞内活性氧浓度、诱导 DNA 的损伤及上调细胞凋亡相关的基因表达等,通过死亡受体通路、线粒体通路与内质网通路促进细胞凋亡。本实验通过不同质量浓度 NS 染毒 AM,荧光显微镜观察发现NS作用后的 AM 细胞核形态发生了改变,且细胞凋亡率增加;同时在 PI3K 特异性抑制剂 LY294002 预处理 AM后,促凋亡蛋白 Bax 上调,抑凋亡蛋白 Bcl-2 降低,说明 PI3K/AKt 信号通路参与了NS粉尘致 AM凋亡的发生过程。

      AKt是 PI3K 下游直接的靶蛋白,它可接收 PI3K 的信号并传递给下游分子;PI3K经典抑制剂LY294002可以特异地抑制 PI3K 的活性,有效阻止 PI3K 依赖的 AKt 磷酸化发生。有研究表明[19-20],SiO2感染后鼠类肺部组织病理切片有大量白细胞浸润,炎症因子白介素-6、肿瘤坏死因子浓度升高,并且可改变PI3K/AKt通路活化状态。而p-PI3K、p-AKt蛋白的表达量是反映 PI3K/AKt 通路活化状态的标志性指标。本实验NS染毒AM 24 h后,p-PI3K、p-AKt蛋白表达水平相对降低,说明NS染毒AM后可抑制PI3K/AKt通路活化。

      本研究还采用流式细胞术检测了细胞凋亡率,发现AM凋亡率随着NS质量浓度增加而上升,相同NS质量浓度时,LY294002预处理组与未处理组相比,AM凋亡率明显上升。另外,细胞线粒体膜电位下降是通过线粒体通透性转换孔的开放,使膜两侧出现电位差及质子浓度梯度,是细胞凋亡早期发生的指标之一[21]。本研究通过JC-1 标记和流式细胞术相结合,检测抑制剂LY294002预处理前后细胞线粒体膜电位下降程度,发现使用LY294002可使AM线粒体膜电位的下降程度增加,说明抑制PI3K/AKt信号通路可促进NS染毒AM凋亡的发生。

      对于凋亡相关蛋白的研究,目前普遍认为Bcl-2具有抵抗细胞凋亡的生物学功能,当其高表达时可维持细胞的存活,对细胞起保护作用;Bax是促细胞凋亡蛋白代表,与Bcl-2具有高度的氨基酸序列同源性。有研究表明[22],Bax/Bcl-2比值是反映细胞凋亡的关键指标,其随着细胞凋亡率上升而增加。本实验结果显示,LY294002预处理后,PI3K/AKt通路处于抑制状态,Bax蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达水平降低,表明通过LY294002抑制PI3K/AKt通路,可促进NS诱导AM凋亡的发生,更直观的验证了PI3K/AKt 通路参与AM的凋亡过程。

      综上所述,短期暴露NS可有效的阻滞AM的PI3K/AKt通路活化状态,增加细胞凋亡率;通过LY294002抑制PI3K/AKt通路后,可上调Bax表达和降低Bcl-2表达,促进AM凋亡事件发生。鉴于PI3K-AKt 通路富集有很多的信号蛋白,本课题组将进一步研究PI3K/AKt上下游分子形成的网络通路与NS作用下机体免疫应答之间的关系,为NS粉尘引起的相关疾病诊疗提供新的治疗方案。

参考文献 (22)

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