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shRNA沉默CCAT2对非小细胞肺癌耐顺铂细胞A549的影响

贺亮 杜泽东 王阳 蒙荣钦 赵文武

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栏目: 论  著

shRNA沉默CCAT2对非小细胞肺癌耐顺铂细胞A549的影响

    通讯作者: 杜泽东, 1366977924@qq.com
  • doi: 10.12182/20200560601

Column:  

Effects of shRNA on Cisplatin-resistant Non-small Cell Lung Cancer Cell A549 via Silencing CCAT2

    Corresponding author: DU Ze-dong, 1366977924@qq.com ;
  • 摘要: 目的 研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默结肠癌相关转录因子2(colon cancer associated transcript 2, CCAT2)对非小细胞肺癌耐顺铂(cisplatin,DDP)细胞株(A549/DDP)的增殖、侵袭和凋亡以及体内肿瘤形成的影响。 方法 shRNA-CCAT2(sh-CCAT2)或shRNA-阴性对照(shRNA-NC)转染A549/DDP细胞(并设未经处理的A549/DDP细胞为对照组),通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测3组A549/DDP细胞CCAT2 mRNA表达;通过MTT实验检测3组A549/DDP细胞经过不同质量浓度(0~8 mg/L)DDP处理后的增殖能力变化,并依此选定2 mg/L DDP进行后续实验。采用克隆形成实验、流式细胞法、Transwell实验检测2 mg/L DDP处理对各组细胞(并设未经处理的A549/DDP细胞为对照组)增殖、凋亡、侵袭的影响,用Western blot检测各组细胞增殖标记蛋白〔Ki67蛋白、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)〕、凋亡标记蛋白(Caspase-3、Caspase-9)、侵袭标记蛋白〔血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)〕蛋白的表达。裸鼠皮下注射A549/DDP细胞、转染shRNA-NC和转染sh-CCAT2的 A549/DDP细胞,每3 d腹腔注射DDP 2 mg/kg,连续给药7次,另设对照组(皮下注射A549/DDP细胞,腹腔注射等量生理盐水)。检测每5 d肿瘤体积,共30 d。30 d后处死取肿瘤组织,RT-PCR检测CCAT2 mRNA表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡。 结果 与对照组和shRNA-NC转染组相比,sh-CCAT2转染A549/DDP细胞后,细胞CCAT2 mRNA表达降低(P<0.01),2~8 mg/L DDP作用后细胞增殖抑制更明显(P<0.01)。与对照组相比,DDP处理的3组细胞克隆形成减少,增殖标记蛋白Ki67和PCNA表达减少(P<0.01);细胞凋亡率增加,凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达增多(P<0.01);细胞侵袭数目减少,侵袭标记蛋白VEGF和MMP-14表达降低(P<0.01);DDP处理的3组细胞中,sh-CCAT 2转染的细胞上述表现最为明显(P<0.01)。体内实验显示,与对照组相比,3个DDP组肿瘤体积减小,30 d时差异有统计学意义(P<0.01);肿瘤组织CCAT2 mRNA表达减少(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01)。3个DDP组中,接种sh-CCAT2转染的 A549/DDP细胞组上述表现最为明显(P<0.01)。 结论 sh-CCAT2可以抑制A549/DDP细胞的增殖、诱导细胞凋亡和降低细胞的侵袭能力,从而抑制A549/ DDP细胞生长。
  • 图 1  qRT-PCR检测CCAT2 mRNA的表达(n=3)

    Figure 1.  CCAT2 mRNA expression was detected by qRT-PCR (n=3)

    图 2  sh-CCAT2对DDP处理的细胞增殖能力的影响(n=3)

    Figure 2.  Effect of sh-CCAT2 on cell proliferation of DDP-treated cells(n=3)

    图 3  各组细胞克隆形成(A,×200)和Western blot检测Ki67、PCNA蛋白的表达(B)

    Figure 3.  Cellular clone formation (A, ×200) and the expression of Ki67 and PCNA proteins (B) in each group by Western blot assay

    图 4  流式细胞法检测各组细胞凋亡(A)和Western blot检测Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达(B)

    Figure 4.  Apoptosis rate detected by flow cytometry (A) and protein expressions of Caspase-3 and Caspase-9 by Western blot (B)

    图 5  用DDP处理A549/DDP细胞后,以Transwell 实验检测细胞侵袭能力(A,×400),Western blot检测VEGF、MMP-14蛋白表达(B)

    Figure 5.  Cell invasion detected by Transwell test (A,×400) and protein expressions of VEGF and MMP-14 by Western blot (B) in DDP-treated A549/DDP cells

    图 6  sh-CCAT2对A549/DDP细胞作用后的小鼠体内实验(n=6)

    Figure 6.  In vivo experiment of the effect of sh-CCAT2 on cell A549/DDP (n=6)

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-25
  • 录用日期:  2019-10-12
  • 网络出版日期:  2020-05-25
  • 刊出日期:  2020-05-01

栏目: 论  著

shRNA沉默CCAT2对非小细胞肺癌耐顺铂细胞A549的影响

    通讯作者: 杜泽东, 1366977924@qq.com
  • 1. 成都市三六三医院 肿瘤科 (成都 610041)
  • 2. 重庆医科大学附属第一医院 肿瘤科 (重庆 400016)

摘要:  目的 研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默结肠癌相关转录因子2(colon cancer associated transcript 2, CCAT2)对非小细胞肺癌耐顺铂(cisplatin,DDP)细胞株(A549/DDP)的增殖、侵袭和凋亡以及体内肿瘤形成的影响。 方法 shRNA-CCAT2(sh-CCAT2)或shRNA-阴性对照(shRNA-NC)转染A549/DDP细胞(并设未经处理的A549/DDP细胞为对照组),通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测3组A549/DDP细胞CCAT2 mRNA表达;通过MTT实验检测3组A549/DDP细胞经过不同质量浓度(0~8 mg/L)DDP处理后的增殖能力变化,并依此选定2 mg/L DDP进行后续实验。采用克隆形成实验、流式细胞法、Transwell实验检测2 mg/L DDP处理对各组细胞(并设未经处理的A549/DDP细胞为对照组)增殖、凋亡、侵袭的影响,用Western blot检测各组细胞增殖标记蛋白〔Ki67蛋白、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)〕、凋亡标记蛋白(Caspase-3、Caspase-9)、侵袭标记蛋白〔血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)〕蛋白的表达。裸鼠皮下注射A549/DDP细胞、转染shRNA-NC和转染sh-CCAT2的 A549/DDP细胞,每3 d腹腔注射DDP 2 mg/kg,连续给药7次,另设对照组(皮下注射A549/DDP细胞,腹腔注射等量生理盐水)。检测每5 d肿瘤体积,共30 d。30 d后处死取肿瘤组织,RT-PCR检测CCAT2 mRNA表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡。 结果 与对照组和shRNA-NC转染组相比,sh-CCAT2转染A549/DDP细胞后,细胞CCAT2 mRNA表达降低(P<0.01),2~8 mg/L DDP作用后细胞增殖抑制更明显(P<0.01)。与对照组相比,DDP处理的3组细胞克隆形成减少,增殖标记蛋白Ki67和PCNA表达减少(P<0.01);细胞凋亡率增加,凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达增多(P<0.01);细胞侵袭数目减少,侵袭标记蛋白VEGF和MMP-14表达降低(P<0.01);DDP处理的3组细胞中,sh-CCAT 2转染的细胞上述表现最为明显(P<0.01)。体内实验显示,与对照组相比,3个DDP组肿瘤体积减小,30 d时差异有统计学意义(P<0.01);肿瘤组织CCAT2 mRNA表达减少(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01)。3个DDP组中,接种sh-CCAT2转染的 A549/DDP细胞组上述表现最为明显(P<0.01)。 结论 sh-CCAT2可以抑制A549/DDP细胞的增殖、诱导细胞凋亡和降低细胞的侵袭能力,从而抑制A549/ DDP细胞生长。

English Abstract

Column:  

  • 肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,在所有癌症中死亡率最高,而其中非小细胞肺癌约占所有肺癌患者的85%[1-2]。非小细胞肺癌易发生转移,一般确诊时已是癌症晚期,目前治疗效果有限,主要采用顺铂(cisplatin,DDP)进行化疗,但由于铂类药物在临床使用上存在较为严重的耐药性,导致肺癌治疗更加困难,研究显示,非小细胞肺癌5年生存率仅15%,预后极差[3-4]。为了提高肺癌患者的预后,开发新的药物或增强非小细胞肺癌细胞的DDP敏感性尤为迫切。长链非编码RNA是一种新型肿瘤生物标志物,可为癌症的早期诊断和治疗提供一种新策略[5]。而结肠癌相关转录因子2(colon cancer associated transcript 2,CCAT2)是在结肠癌发现的一个长链非编码RNA,由染色体8q24这一保守区转录而来,其与结肠癌、乳腺癌和肺癌的发生和发展有关[6]。已有研究表明,CCAT2是一种非小细胞肺癌细胞中特异性表达的长链非编码RNA,可以促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭,并且以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰CCAT2能够抑制非小细胞肺癌细胞系的体外增殖和侵袭[7]。但是沉默CCAT2能否抑制非小细胞肺癌耐药细胞株的增殖和侵袭还不清楚。本研究利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默CCAT2,研究其对非小细胞肺癌耐药细胞株的增殖、侵袭和凋亡的影响,以及对体内肿瘤形成的影响,为后续非小细胞肺癌的分子治疗和化疗相结合提供参考依据。

    • 耐DDP人肺癌细胞株A549/DDP购自上海慧颖生物科技有限公司;shRNA-CCAT2(sh-CCAT2)和shRNA无义序列阴性对照(shRNA-NC)及相关引物序列由上海生工生物有限公司设计并合成;热灭活胎牛血清、青霉素、链霉素、RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司;DDP购自西安凯萌生物技术有限公司;转染试剂盒lipofectamine 3000购自Thermo公司;Trizol 试剂购自美国Life Technologies公司,BCA试剂盒、MTT试剂盒购自北京索宝科技有限公司;Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase-3、Caspase-9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)抗体购自碧云天生物科技有限公司;ECL发光底物购自上海慧颖生物科技有限公司;GIMESA染色液 购自北京中生瑞泰科技有限公司,TNUEL检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司,裸鼠购自四川大学华西医院基因工程小鼠中心。 CF×96实时定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

    • 将A549/DDP细胞菌株置于含10%热灭活胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 U/mL)的RPMI-1640培养液中,在体积分数为5% CO2、37 ℃孵箱中培养。将细胞随机分为对照组、shRNA-NC组和sh-CCAT2组。细胞培养24 h后,根据转染试剂盒说明将构建的shRNA-NC(20 ng/μL)和sh-CCAT2(20 ng/μL)分别转染入A549/DDP细胞。对照组细胞不进行转染处理。

    • 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CCAT2mRNA表达。取转染5 d后的各组A549/DDP细胞,利用Trizol 试剂提取细胞总RNA,用反转录试剂盒合成cDNA,qRT-PCR仪进行基因片段扩增。PCR引物序列:CCAT2 F:5′- CCCTGGTCAAATTAACCT-3′, R:5′-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATGGAT-3′。反应条件:95 ℃ 预变性3 min,然后95 ℃ 10 s,57 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,总共40 个循环。最后72 ℃延伸2 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,计算ΔCt,以2-ΔΔCt表示CCAT2 mRNA的表达量,并以对照组CCAT2 mRNA表达为1,计算其他组相对于对照组的表达量。

    • A549/DDP细胞分为DDP组(不同质量浓度DDP处理A549/DDP细胞)、DDP+shRNA-NC组(不同质量浓度DDP处理shRNA-NC转染的A549/DDP细胞)和DDP+sh-CCAT2组(不同质量浓度DDP处理sh-CCAT2转染的A549/DDP细胞),以各组细胞未加DDP处理前为自身对照。DDP不同质量浓度分别为2、4、6、8 mg/L。将各组A549/DDP细胞(A549/DDP细胞、shRNA-NC转染的A549/DDP细胞、sh-CCAT 2转染的A549/DDP细胞)以每孔1 000个细胞接种于96孔板,培养24 h后加入上述不同质量浓度DDP,培养3 d后,每孔加20 μL MTT溶液(PBS配制成5 mg/mL,pH=7.4)继续孵育4 h,终止培养,弃上清。每孔加150 μL DMSO,振荡10 min,酶标仪测定490 nm波长处吸光度(A)值。重复实验3次。按常规计算细胞存活率, 以存活率间接反映细胞增殖能力。选择合适的DDP质量浓度进行后续实验。

    • 将A549/DDP细胞分为对照组(未处理的A549/DDP细胞)、DDP组(DDP 2 mg/L处理A549/DDP细胞)、DDP+shRNA-NC组(DDP 2 mg/L处理shRNA-NC转染的A549/DDP细胞)和DDP+sh-CCAT2组(DDP 2 mg/L处理sh-CCAT2转染的A549/DDP细胞)。

    • 取对数期生长的A549/DDP细胞,按分组接种于完全培养基,200个细胞/孔,体积分数为5% CO2,37 ℃培养2周,用Gimesa染色,在200倍显微镜下任意选取5个视野,观察每视野中细胞克隆数目。

    • 采用Western blot检测增殖标记蛋白(Ki67和PCNA)、凋亡标记蛋白(Caspase-3和Caspase-9)、侵袭标记蛋白(VEGF和MMP-14)的表达。用RIPA裂解液提取培养3 d的各组细胞总蛋白。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度,10% SDS-PAGE分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h,随后加入一抗(Ki67, 1∶1 000; PCNA, 1∶1 000; cleaved Caspase-3, 1∶1 000; cleaved Caspase-9, 1∶1 000; VEGF, 1∶1 000; MMP-14 1∶1 000)于4 ℃封闭过夜,第二天加入对应二抗室温封闭1 h,最后滴ECL曝光。以GAPDH为内参对照。图像采用Bio-Rad凝胶成像系统拍照并测定各显色条带的灰度值,以目的条带与GAPDH灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

    • 将各组A549/ DDP细胞培养24 h后,用胰酶消化,3 500×g离心 5 min,再按每毫升106个细胞的浓度重悬。细胞悬液中加入5 mL Annexin-V- FITC和5 mLPI,在黑暗的房间里孵化15 min,然后用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=早期细胞凋亡率(%)+晚期细胞凋亡率(%)。将各组A549/ DDP细胞培养24 h后,胰酶消化,3 500×g,离心5 min,细胞再按1×106 mL−1浓度重悬。细胞悬液中加入5 mL Annexin-V- FITC和5 mL PI,在黑暗的房间里孵化15 min,然后用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=早期细胞凋亡率(%)+晚期细胞凋亡率(%)。

    • 将各组A549/DDP细胞以无血清培养液培养24 h后,用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代接种于用Matrigel预处理的Transwell小室中,细胞密度为3×105 mL−1。小室上层加入无血清培养液培养细胞,下层则加入含血清的正常培养液。48 h后用无菌棉签擦去小室上层细胞,下层细胞结晶紫染色后计数统计。倒置显微镜下随机选择5个高倍视野(HP, ×400)拍照,计算每个HP下的细胞数,实验重复3次。

    • 将24只裸鼠随机分为DDP组、DDP+shRNA-NC组、DDP+sh-CCAT2组和对照组,每组6只。DDP组为裸鼠皮下注射未处理的A549/DDP细胞并腹腔给药DDP;DDP+shRNA-NC组为裸鼠皮下注射shRNA-NC转染的A549/DDP细胞并腹腔给药DDP;DDP+sh-CCAT2组为皮下注射sh-CCAT2转染的A549细胞并腹腔给药DDP;对照组为裸鼠皮下注射未处理的A549/DDP细胞,相应时间腹腔注射等量生理盐水。各组裸鼠皮下注射A549/DDP细胞密度为2×105 mL−1,腹腔注射给药为每3 d给药1次,每次注射DDP 2 mg/kg,连续给药7次。每5 d测量1次肿瘤体积, V=长×宽2/2(mm3)。绘制肿瘤生长曲线。30 d后处死裸鼠,取肿瘤组织标本,部分进行qRT-PCR检测CCAT2 mRNA表达,部分进行TUNEL染色检查细胞凋亡。

      CCAT2 mRNA表达检测:提取肿瘤组织总RNA,按试剂盒说明操作。样品均取1 μg总RNA进行DNAseⅠ处理,逆转录依试剂盒说明操作。按1.3进行CCAT2 mRNA表达检测。TUNEL染色:肿瘤组织常规固定、切片,玻片预先用多聚赖氨酸处理以防止脱片。切片脱蜡入水后按试剂盒内使用说明操作,DAB染色,常规脱水、透明、封片,光镜下检查细胞凋亡。棕黄色的为凋亡细胞,细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

    • 数据以$\bar x $±s表示。组间比较采用t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

    • 图1。结果表明:与对照组比较,shRNA-NC组A549/DDP细胞CCAT2 mRNA的表达差异无统计学意义,而sh-CCAT2组细胞CCAT2 mRNA的表达降低(P<0.01),表明转染成功,shRNA沉默了CCAT2 mRNA表达。

      图  1  qRT-PCR检测CCAT2 mRNA的表达(n=3)

      Figure 1.  CCAT2 mRNA expression was detected by qRT-PCR (n=3)

    • MTT实验结果(图2)显示,以未加DDP时(对照)细胞存活率为100%,各组细胞随着DDP质量浓度的升高,细胞存活率逐渐降低,说明DDP可以抑制A549/DDP增殖,其中,2 mg/L DDP处理细胞时,对DDP组和DDP+shRNA-NC组的A549/DDP细胞存活率无明显影响,但sh-CCAT2组细胞存活率下降(P<0.01),因此,后续实验选择用2 mg/L DDP处理细胞;相同DDP质量浓度下,DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞存活率差异无统计学意义,而DDP+sh-CCAT2组与DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞存活率降低(P<0.01),说明shRNA沉默CCAT2可抑制细胞增殖。

      图  2  sh-CCAT2对DDP处理的细胞增殖能力的影响(n=3)

      Figure 2.  Effect of sh-CCAT2 on cell proliferation of DDP-treated cells(n=3)

    • 克隆形成实验结果(图3A)表明,DDP组与对照组比较,A549/DDP细胞克隆形成减少(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,克隆形成变化不明显(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组克隆形成较DDP组和DDP+shRNA-NC组减少(P<0.01),说明shRNA干扰CCAT2抑制细胞增殖,与MTT检测结果相一致。

      图  3  各组细胞克隆形成(A,×200)和Western blot检测Ki67、PCNA蛋白的表达(B)

      Figure 3.  Cellular clone formation (A, ×200) and the expression of Ki67 and PCNA proteins (B) in each group by Western blot assay

      Western blot检测结果(图3B)显示,DDP组与对照组比较,细胞增殖标记蛋白Ki67和PCNA蛋白表达减少(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组细胞Ki67和PCNA蛋白表达差异无统计学意义,DDP+sh-CCAT2组较DDP组和DDP+shRNA-NC Ki67和PCNA蛋白表达减少(P<0.01)。

    • 流式检测(图4A)发现,DDP组与对照组比较,细胞凋亡率增加(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞凋亡率无变化(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组较DDP组和DDP+shRNA-NC组细胞凋亡率增加(P<0.01),说明sh-CCAT2可诱导DDP处理的A549/DDP细胞凋亡。

      图  4  流式细胞法检测各组细胞凋亡(A)和Western blot检测Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达(B)

      Figure 4.  Apoptosis rate detected by flow cytometry (A) and protein expressions of Caspase-3 and Caspase-9 by Western blot (B)

      Western blot检测(图4B)结果显示,DDP组与对照组比较,凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达增多(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达量差异无变化(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组与DDP组、DDP+shRNA-NC组比较,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量增多(P<0.01)

    • Transwell检测实验结果(图5A)显示,DDP组与对照组比较,细胞侵袭数目减少(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞侵袭数目相近(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组与DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞侵袭数目减少(P<0.01),说明sh-CCAT2可降低耐顺铂A549细胞的侵袭能力。

      图  5  用DDP处理A549/DDP细胞后,以Transwell 实验检测细胞侵袭能力(A,×400),Western blot检测VEGF、MMP-14蛋白表达(B)

      Figure 5.  Cell invasion detected by Transwell test (A,×400) and protein expressions of VEGF and MMP-14 by Western blot (B) in DDP-treated A549/DDP cells

      Western blot检测实验结果(图5B)表明,DDP组与对照组比较,侵袭标记蛋白VEGF和MMP-14表达量降低(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞VEGF和MMP-14蛋白表达差异小(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组与DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,VEGF和MMP-14蛋白表达减少(P<0.01),说明sh-CCAT2可降低A549/DDP的侵袭能力。

    • 体内实验中各组裸鼠肿瘤生长曲线见图6A。结果表明:随着接种时间增加,各组裸鼠体内肿瘤体积增大;DDP组与对照组比较,裸鼠肿瘤体积减小(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,肿瘤体积相近(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组与DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,肿瘤体积减小(P<0.01),说明sh-CCAT2可加强DDP抑制肿瘤生长。

      图  6  sh-CCAT2对A549/DDP细胞作用后的小鼠体内实验(n=6)

      Figure 6.  In vivo experiment of the effect of sh-CCAT2 on cell A549/DDP (n=6)

      qRT-PCR检测裸鼠肿瘤组织中CCAT2 mRNA表达结果(图6B)显示,DDP组与对照组比较,CCAT2 mRNA表达减少(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,CCAT2表达量相近(P>0.05),DDP+sh-CCAT2组与DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,CCAT2 mRNA表达进一步减少(P<0.01)。

      裸鼠肿瘤组织TUNEL染色检测结果(图6C)显示,DDP组与对照组比较,细胞凋亡率增加(P<0.01),DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞凋亡率相近( P>0.05),DDP+sh-CCAT2组与DDP组和DDP+shRNA-NC组比较,细胞凋亡率进一步增加(P<0.01)。

    • 由于人口老龄化和空气污染不断加重,恶性肿瘤发病率和死亡率逐年升高[8-9]。肺癌是中国发生率和死亡率最高的恶性肿瘤,并且其一直呈快速增长趋势[10-12]。加强对肺癌治疗效果研究对人们健康至关重要。

      恶性增殖是癌症细胞的基本特征,也是癌症防治的关键,而CCAT2与癌细胞的增殖是有着密切联系。研究发现[13-15],CCAT2在卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌中高表达,沉默CCAT2可以抑制癌细胞的增殖。ZHAO等[16]发现沉默CCAT2能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,但沉默CCAT2是否能够抑制耐DDP非小细胞肺癌细胞增殖并不清楚。本研究结果显示,shRNA沉默非小细胞肺癌耐DDP细胞A549的CCAT2后,细胞的增殖明显减弱,并且增殖标记蛋白Ki67和PCNA表达量减少,说明shRNA沉默CCAT2对非小细胞肺癌耐DDP菌株增殖具有抑制作用。

      细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制,癌症细胞存在着细胞凋亡失衡的现象,CCAT2在癌细胞的凋亡中起着重要作用。研究发现[17-19],CCAT2可以抑制肝癌细胞、卵巢癌细胞的凋亡,沉默CCAT2可以促进其凋亡。本研究发现:shRNA沉默非小细胞肺癌耐DDP细胞A549的CCAT2后,细胞凋亡率增加,凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达量明显增多,这说明sh-CCAT2可诱导耐顺铂细胞的凋亡。

      侵袭是癌症复发和预后不良的主要原因。研究发现[20-22],敲低CCAT2能够降低胰腺导管癌、神经胶质瘤、宫颈癌细胞侵袭能力。本研究结果表明,shRNA沉默非小细胞肺癌耐DDP细胞A549的CCAT2后,细胞侵袭数目减少,侵袭标记蛋白VEGF和MMP-14表达量降低,说明sh-CCAT2能够降低耐顺铂A549细胞的侵袭能力。

      癌症的发生发展与细胞的增殖、侵袭和凋亡息息相关,而CCAT2与在细胞增殖、侵袭和凋亡中都起着重要作用。相比单一的实验外部环境,机体内环境复杂多变。已有体内实验研究发现[23-25],沉默CCAT2会使神经胶质瘤、乳腺癌、胃癌生长受到抑制。本研究体内实验发现,DDP+sh-CCAT2组裸鼠比DDP组裸鼠肿瘤体积减小,肿瘤组织细胞凋亡率明显增加,这说明sh-CCAT2可以抑制耐顺铂A549细胞的生长。

      综上所述,sh-CCAT2可以抑制耐顺铂A549细胞的增殖、诱导凋亡和降低其侵袭能力,从而抑制耐顺铂A549细胞生长,这为肺癌的化疗和结合分子治疗提供了新思路,为进一步研究CCAT2对耐顺铂A549细胞作用的分子机制及提高肺癌治疗效果提供参考。

参考文献 (25)

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