细胞衰老是二倍体细胞中发生的细胞生长的永久停滞，这种现象首先由HAYFLICK描述，称为“HAYFLICK极限”，这种细胞衰老由端粒耗损引起，称之为复制性衰老^[1]。然而，二倍体细胞在某些刺激（例如癌基因过度表达、电离辐射、氧化应激）下也会经历加速的衰老反应，而不受端粒耗损的影响，称之为早衰^[2-3]。目前，已建立了一系列细胞衰老的鉴定标志物^[4-6]。首先，通过不可逆的生长停滞和扩大的扁平细胞形态来鉴定衰老细胞；其次，衰老细胞的特征在于衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的活性更高，并且获得衰老相关的异染色质灶形成（SAHF），即衰老相关的分泌表型（SASP）；最后，衰老细胞通常表达增加的细胞周期抑制剂，包括p16^INK4a、p21^CIP1和TP53。葡萄球菌核酸酶和tudor结构域1(staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1, SND1) 是一个多功能蛋白，且在乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝细胞癌和恶性胶质瘤中过表达^[7-8]。分子研究揭示了SND1参与调节基因表达在转录和转录后水平^[9-10]。目前，SND1在细胞衰老和老年组织中的调控作用还未曾报道。本研究旨在研究转录共激活因子SND1在衰老细胞和老年组织中的表达情况，明确SND1对细胞衰老的调控机制。

1.   材料与方法

1.1   主要材料

人胚肺二倍体成纤维细胞2BS购自中国北京国家生物制品研究所。HEK293T细胞来自本实验室，用于质粒系统慢病毒的包装。结肠腺瘤组织和正常结肠组织来源于十堰市太和医院病理科。Trizol试剂和胎牛血清购自Invitrogen公司；DMEM购自Sigma公司；逆转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；β半乳糖苷酶染色试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；CCK8试剂盒购自日本同仁公司；EDU试剂盒购自广州锐博；生物安全柜和细胞培养箱购自Thermo scientific公司；凝胶成像系统购自Bio-rad公司。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

所有细胞使用DMEM培养基培养，并加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的加湿培养箱中培养。

1.2.2   诱导2BS细胞衰老和Western blot分析

诱导2BS细胞衰老方法：将博来霉素（购买自Selleck公司）粉末配制成1 mg/mL质量浓度溶液。将1 mg/mL博来霉素溶液加入到提前换好新鲜培养基的2BS细胞培养皿中，摇晃均匀，随后将培养皿放置培养箱中，24 h后更换新鲜培养基，随后培养至第7天，2BS细胞形状发生改变并停止生长，表明其进入衰老状态。Western blot 分析：将正常2BS细胞（代表年轻细胞）和经博来霉素诱导老化（经典的诱导细胞衰老方法）后的2BS细胞置于含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解buffer中中进行裂解，得到的上层清液进行10%SDS-PAGE分离，然后电转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭非特异位点，用β-actin(货号M177-3，MBL公司)、SND1(货号ab225620，Abcam公司)、P53(货号sc-126，Santa Cruz公司)和P16(货号ab51243，Abcam公司)一抗进行4 ℃过夜孵育(稀释比例均为1∶1 000)。TBST洗3次后，用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1 h(二抗稀释比例为1∶10 000)，最后用增强的化学发光仪进行显像。

1.2.3   免疫荧光染色

在培养板中将已爬好正常2BS细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用体积分数为4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.5% TritonX-100（PBS配制）室温通透20 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的SND1一抗，并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的 荧光 (FITC)标记羊抗兔 标记羊抗兔IgG，湿盒中20~37 ℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；注意从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行；滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。

1.2.4   免疫组化染色分析

本研究用人结肠腺瘤组织作为衰老模型^[11]，正常结肠组织作为正常对照。免疫组化(IHC)分析按文献方法进行^[12]。将甲醛溶液固定的结肠腺癌组织和正常结肠组织石蜡切片脱蜡、复水，3%H₂O₂预处理20 min，阻断内源性过氧化物酶。98 ℃微波处理10 min，提取抗原的抗体结合表位，切片与10%山羊血清预孵育，阻断非特异性结合，随后加入SND1一抗在4 ℃孵育过夜，加入鼠兔通用型二抗(稀释倍数1∶1 000，货号PV-6000，中杉金桥公司)，最后用DAB试剂盒进行显色，苏木精进行中和染色。

1.2.5   shRNA质粒构建和转染

合成针对SND1的shRNA和阴性对照的shRNA(sh-ctrl)序列，由北京迈津生物科技有限公司合成，随后将其连接到Plent-U6-GFP-Puro载体上。为了保证shSND敲低效果，我们针对SND1mRNA区域分别设计了3个shRNA靶点，即shSND1-1、shSND1-2和shSND1-3，这样能保证敲低的特异性和可靠性。shSND1-1序列：GTGTGGCTCCCACAGCTAATTT，shSND1-2序列：GAAGGCATGAGAGCTAATAA，shSND1-3序列：GCTGATGATGCAGACGAATT，sh-ctrl: GTTCTCCGAACGTGTCACGT。将携带shSND1-1、shSND1-2和sh-ctrl序列的Plent-U6-GFP-Puro质粒（购自北京迈津生物科技有限公司）与慢病毒包装质粒PMD2G和PSPAX2（本实验保存）在HEK293T细胞中包装成慢病毒，将收集的慢病毒感染2BS细胞，感染48 h后，通过Western blot检测各组细胞中SND1的表达水平。

1.2.6   CCK8和EDU分析

分别用CCK8细胞计数盒和EDU DNA细胞增殖试剂盒检测shSND1-1组、shSND1-2组和sh-ctrl组2BS细胞的增殖能力，操作方法依据试剂盒说明进行。

1.2.7   克隆形成分析

将上述每组1 000个细胞接种到3.5 cm培养皿中，然后在37 ℃下孵育14 d，期间每隔2 d更换一次培养基。14 d后，用体积分数为4%多聚甲醛固定细胞集落，随后用0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗3遍后，用显微镜成像并计数。

1.2.8   SASP表达芯片检测

为了研究敲低SND1对SASP的影响，本研究将对照组(sh-ctrl)和SND1敲低组(shSND1)2BS细胞进行SASP表达芯片检测，表达芯片检测由上海美吉生物完成。

1.2.9   RT-qPCR

使用Trizol试剂提取对照组和SND1敲低组细胞总RNA，取2 μg RNA用逆转录试剂盒ReverTra Ace^®qPCR RT进行逆转录得到cDNA，随后采用SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix以cDNA为模板进行扩增。反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。目的基因相对内参的表达丰度通过2^–ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。

表  1  各引物序列

Table  1.  Sequence of prime

Prime	Sequence (5′-3)
	F	R
SND1	GAGTATGGCATGATCTACCTTGG	GCCGGTTCTGCTCAGGATT
IL-8	ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC	AACCCTCTGCACCCAGTTTTC
HGF	GCTATCGGGGTAAAGACCTACA	CGTAGCGTACCTCTGGATTGC
AREG	GAGCCGACTATGACTACTCAGA	TCACTTTCCGTCTTGTTTTGGG
EREG	GGACAGTGCATCTATCTGGTGG	TTGGTGGACGGTTAAAAAGAAGT
IL-6	ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG	CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG
MMP1	GGGGCTTTGATGTACCCTAGC	TGTCACACGCTTTTGGGGTTT
MMP3	CTGGACTCCGACACTCTGGA	CAGGAAAGGTTCTGAAGTGACC
CXCL1	CACAGCTGCAGAGGCCACCTG	GGACAGTGTGCAGGTAGAG
CXCL2	GGTGGCTGTTCCTGAAGGAGG	GCAAGTAGATTCAATCATAACC
SND1：Staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1；IL-8：Interleukin-8; HGF： Hepatocyte growth factor; AREG：Amphiregulin; EREG：Epiregulin; IL-6：Interleukin-6; MMP1： Matrix metalloproteinase 1; MMP3： Matrix metalloproteinase 3; CXCL1： C-X-C motif chemokine ligand 1; CXCL2：C-X-C motif chemokine ligand 2

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1.2.10   β半乳糖苷酶染色

依据文献方法^[13-14]进行操作，检测shSND1-1组、shSND1-2组和sh-ctrl组细胞的衰老细胞比例。

1.2.11   统计学方法

实验结果用$\bar x \pm s$描述。采用t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   衰老细胞和老年组织中的SND1表达下调

Western blot检测结果（图1）表明，SND1在衰老细胞中的表达较年轻细胞显著下调，细胞衰老的标志分子P16和P53在衰老细胞中上调表达。细胞免疫荧光表明，SND1主要定位在年轻2BS细胞胞浆(图2)。免疫组化染色结果(图3)表明，SND1在人结肠腺瘤组织中的表达较正常结肠组织降低。

图  1  衰老和年轻2BS细胞中SND1、P16和P53蛋白的表达

Figure  1.  Western blot detected the expression of SND1, P16 and P53 in senescent and young 2BS cells

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图  2  SND1蛋白在年轻2BS细胞中的定位。 免疫荧光染色 ×100

Figure  2.  The location of SND1 in young 2BS cells. Immunofluorescence ×100

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图  3  SND1在老年组织中的表达下调。 IHC ×20

Figure  3.  The expression of SND1 in human colon non-lesion tissues and human colon adenoma tissues. IHC ×20

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2.2   sh-SND1抑制了2BS细胞的增殖和克隆形成能力

Western blot检测结果（图4A）发现，转染了shSND1的shSND1组2BS细胞中SND1蛋白相对表达水平明显低于sh-ctrl组细胞。CCK8、EDU和克隆形成分析结果（图4B～4D）表明，相对于sh-ctrl组2BS细胞，shSND1组2BS细胞增殖能力和克隆形成能力出现减弱（P<0.01）。

图  4  敲低SND1抑制了2BS细胞的增殖和克隆形成能力

Figure  4.  Knockdown of SND1 inhibits proliferation and colony formation of 2BS cells

A: Western blot detected the knockdown efficacy of SND1 in young 2BS cells; B: CCK8 measured the proliferative ability of 2BS cells; C: EDU measured the proliferative ability of 2BS cells (**P<0.01); D: Colony formation assay evaluated the capacity of colony formation (**P<0.01)

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2.3   敲低SND1上调SASP而促进2BS细胞衰老

SASP表达芯片检测结果表明，敲低SND1上调了IL-6、MMP1和MMP3的表达（同时出现了衰老标志的表达改变，如增加的P16和P53表达，减少的LamB1表达），且KEGG分析显著富集于细胞周期和DNA复制等信号通路上（图5）。

图  5  3组2BS细胞的RNA测序分析

Figure  5.  RNA sequencing analysis of 2BS cells transfected with sh-ctrl and shSND1 plasmids

A：Results of SASP represents chip detection; B: KEGG enrichment based on RNA sequencing analysis (sh-ctrl vs. shSND1)

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RT-qPCR结果（图6）表明，shSND1组白细胞介素（IL）-8、趋化因子CXCL-2、肝细胞生长因子（HGF）、IL-6、基质金属蛋白酶（MMP）1和MMP3的表达较sh-ctrl组上调(P<0.05, P<0.01, P<0.001)。衰老相关SA-β-gal染色（图7）揭示了shSND1组较sh-ctrl组衰老细胞比例增加（P <0.01，P<0.001）。

图  6  RT-qPCR检测SASP组分表达改变(n=3)

Figure  6.  RT-qPCR detected the altered expression of SASP components (n=3)

**P<0.01, ***P<0.001, vs. sh-ctrl

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图  7  SA-β-gal染色检测3组2BS细胞增殖能力( n =3)。 ×10

Figure  7.  SA-β-gal staining evaluated the senescent 2BS cells ( n =3). ×10

**P<0.01, ***P<0.001

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3.   讨论

细胞衰老是一种肿瘤抑制机制，可永久地阻止细胞处于恶变的风险中^[15-16]。然而，许多证据表明，衰老细胞对组织微环境产生有害影响。这些影响中最重要的是衰老的成纤维细胞获得SASP进而转变为促炎性细胞而促进肿瘤发展^[17-18]。因此，鉴定SASP的上游调节分子可为干预细胞衰老和肿瘤提供新的靶点。

SND1是一个转录共激活因子，在基因表达调控方面起着重要作用，如RNA剪接、RNA干扰、RNA稳定性和RNA编辑^[19]。已发表的研究证明了SND1在许多肿瘤中发挥了癌基因的作用，进而促进肿瘤的发生和转移^{[9, 19-20]}。此外，已证实一些microRNA参与调控SND1而调节肿瘤的发生和转移。EMDAD 等^[21]揭示了SND1是miR-184的一个直接靶点，抑制miR-184导致SND1上调表达，进而促进恶性胶质瘤的发展。然而，目前SDN1在衰老细胞和老年组织中的调控作用报道甚少。

在此，我们首先通过Western blot和免疫组化揭示了SND1在衰老的2BS细胞和人结肠腺瘤组织中表达下调，此结果与SND1在癌组织的表达模式是一致的，表明SND1高表达可驱使细胞绕过衰老阶段而进入癌变时期。随后，我们采用shRNA敲低SND1，结果发现敲低SND1抑制了2BS细胞的增殖和克隆形成能力，表明SND1对一些细胞周期调控基因具有转录激活作用，敲低SND1可减弱细胞周期调控基因的转录，进而抑制细胞增殖。我们通过转录组测序和RT-qPCR分析进一步研究发现敲低SND1上调了IL-8、CXCL-2、HGF、IL-6、MMP1和MMP3等SASP成分，下调的SND1通过改变SASP表达谱进而调控人二倍体细胞衰老。

总之，转录共激活因子SND1在衰老的2BS细胞和衰老组织人结肠腺瘤组织中的表达降低，SND1通过调控SASP进而调节人二倍体成纤维细胞衰老。