甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)约占甲状腺癌总数80%，是最常见的一种甲状腺癌^[1]。近年来，PTC发病率的增长速度位居女性肿瘤首位^[2]，目前已知PTC的发生发展会受到激素、遗传、环境等因素的影响^[3]。有研究报道，雌激素在PTC的发展中发挥关键作用，而雌激素对PTC细胞的作用主要由雌激素受体（ER）α和ERβ介导，其中ERα表达与细胞异常增殖和恶性肿瘤的发展有关，相反，ERβ可抑制细胞增殖、迁移和侵袭^[4]。

泛素样含PDH和环指域1（UHRF1）是与细胞增殖和表观遗传调节相关的多结构域蛋白，是一种众所周知的肿瘤标志物^[5]。近年来研究发现UHRF1在乳腺癌^[6]、胃癌^[7]、宫颈癌^[8]等肿瘤中不仅自身表达失调，而且抑制抑癌基因，参与多种肿瘤的增殖、侵袭和迁移等过程。目前，UHRF1在PTC发展中的作用机制尚不清楚。鉴于ERβ在PTC发展中发挥抑癌基因的作用，我们猜测：UHRF1能否调控抑癌基因ERβ表达，进而改变ERα/ERβ表达比率并参与PTC发生发展过程？这种调控机制国内外鲜见报道。

本研究以人PTC的BCPAP细胞为模型，探讨UHRF1对雌激素受体ERα/ERβ表达和PTC发展的影响，为PTC临床治疗和靶向研究提供更多的理论依据。

1.   材料与方法

1.1   主要试剂

胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Hyclone公司；RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝胶试剂盒和免疫印迹化学发光剂ECL购自碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂盒和定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM购自TaKaRa公司；兔抗人UHRF1和β-actin多克隆抗体购自Bioworld公司；兔抗人ERα和ERβ多克隆抗体购自Abcam公司；Lipofectamine RNAiMAX购自Invitrogen公司；PCR引物、Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA序列由上海生工生物工程有限公司合成；MTT试剂盒购自美国Sigma公司；Transwell小室和Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2   细胞培养及转染

将本实验室保存的人PTC细胞BCPAP和人甲状腺滤泡上皮正常细胞Nthy-ori3-1贴壁培养于含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，在37 ℃、体积分数为5%CO₂的细胞培养箱环境下培养细胞，根据细胞生长状态换液或传代，随后按照Lipofectamine RNAiMAX使用说明书转染对数生长期的BCPAP细胞。转染前一天将BCPAP细胞按3×10⁵/孔接种于6孔板内培养，待细胞融合度达到60%~80%时转染siRNA。UHRF1 siRNA正义链：5′-GUGGCAAGAAUAGCAAGUATT-3′，反义链：5′-UACUUGCUAUUCUUGCCACTT-3′；Scrambled siRNA正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。用无血清无抗生素的RPMI1640培养基稀释 UHRF1 siRNA、Scrambled siRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室温静置5 min后，再将两者混匀室温静置20 min，随后将混合溶液加入对应细胞孔并置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的细胞培养箱环境下培养6 h后，更换含100 mL/L FBS的RPMI1640培养基继续培养48 h后收取细胞。将PTC细胞BCPAP分为空白对照组、Scrambled siRNA组和UHRF1 siRNA组。

1.3   Western blot检测UHRF1、ERα和ERβ的蛋白表达

用RIPA裂解液和PMSF提取培养48 h后Nthy-ori3-1和BCPAP细胞与转染后的各组细胞总蛋白，测定UHRF1、ERα和ERβ的蛋白浓度。配置分离胶和浓缩胶后，每孔加入30 μg蛋白进行电泳，随后将分离的目的条带电转移到PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，PBST洗膜后放入一抗稀释液 4 ℃孵育过夜，PBST洗膜后再将膜放入二抗稀释液37 ℃孵育2 h, PBST洗膜后发光显影，分析实验数据，以目的条带与β-actin灰度值的比值为目的蛋白的相对含量。实验重复3次。

1.4   实时荧光定量（qRT）-PCR检测UHRF1、ERα和ERβ的mRNA表达水平

首先用RNA提取试剂盒提取培养48 h后Nthy-ori3-1和BCPAP细胞与转染后的各组细胞总RNA，然后逆转录成cDNA，最后按照SYBR Premix Ex Taq^TM说明书进行扩增，引物设计如下：UHRF1上游引物5′-CAGGCAGACAAGCTGTTGG-3′，下游引物：5′-AACAGCTCCTGGATCTTCCG-3′；ERα上游引物：5′-AGCCTCCTGTCTACCGACTC-3′,下游引物：5′-GCAGGAGAAAGGAGCATGGA-3′；ERβ上游引物：5′-TTGACATGCTCCTGGCAACT-3′,下游引物: 5′-GGCCCAGCTGTGTGATTACT-3′；β-actin上游引物:5′-GGAGAAGATGACCCAGATCA-3′，下游引物5′-GATCTTCATGAGCTAGTCAG-3′。所有基因均使用β-actin为内参，实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，实验重复3次，用公式2^－ΔΔCt计算基因相对表达量。

1.5   MTT检测BCPAP细胞增殖

将对数生长期的BCPAP细胞，经胰酶消化后制成单细胞悬液，以5×10³/孔的细胞数接种于96孔板，培养于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵育箱中，孵育24 h；细胞贴壁后分组处理细胞，继续培养48 h，每孔加入20 μL MTT (5 mg/mL)继续培养4 h。终止培养弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，充分溶解，震荡10 min，显色，570 nm处测定每孔吸光度值，以空白对照组细胞活力为100%，计算各组细胞增殖率，公式：增殖率=（实验组值－空白孔组值）/（空白对照组值－空白孔组值）×100%。实验重复3次。

1.6   Transwell检测BCPAP细胞侵袭和迁移

侵袭实验：无血清RPMI1640培养基按8∶1稀释Matrigel胶后，在Transwell小室上室中每孔均匀铺入60 μL，小室放于24孔培养板中，37 ℃孵育1 h。转染24 h后收集空白对照组、Scrambled siRNA组和UHRF1 siRNA组的细胞。按1×10⁵/孔细胞密度接种于上室，并加入100 μL RPMI1640无血清培养基，将600 μL含100 mL/L FBS的RPMI1640培养基加入下室。37 ℃孵箱培养24 h后甲醇固定30 min，1 g/L结晶紫染色10 min，计数200倍光镜下随机选取的5个视野的细胞数目，实验重复3次。

迁移实验：在实验中不铺Matrigel胶，取出在37 ℃、体积分数为5%CO₂环境下培养24 h后的小室，其余步骤与侵袭实验一致。

1.7   统计学方法

实验数据以$\bar x$ ± s表示。组间比较采用t检验、单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Nthy-ori3-1和BCPAP细胞中UHRF1、ERα、ERβ的蛋白表达

见图1。与Nthy-ori3-1细胞比较，BCPAP细胞中的UHRF1和ERα的蛋白表达水平增高，而ERβ蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。在Nthy-ori3-1细胞中，ERα蛋白表达水平明显低于ERβ蛋白表达水平，ERα/ERβ蛋白比率为0.44，而在BCPAP细胞中，ERα蛋白表达水平高于ERβ蛋白表达水平，ERα/ERβ蛋白比率为2.37。

图  1  Western blot检测Nthy-ori3-1、BCPAP细胞中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白表达

Figure  1.  The protein expressions of UHRF1, ERα and ERβ in Nthy-ori3-1 and BCPAP cells detected by Western blot

* P<0.05, vs. Nthy-ori3-1 group (n=3)

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2.2   Nthy-ori3-1和BCPAP细胞中UHRF1、ERα、ERβ的mRNA表达

见图2。BCPAP细胞中UHRF1 mRNA表达水平（16.91±1.59）高于Nthy-ori3-1细胞（6.36±0.73）。与Nthy-ori3-1细胞比较，BCPAP细胞中ERα mRNA表达水平增高，而ERβ mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。在Nthy-ori3-1细胞中，ERα mRNA表达水平明显低于ERβ mRNA表达水平，ERα mRNA/ERβ mRNA比率为0.35，而在BCPAP细胞中，ERα mRNA表达水平明显高于ERβ mRNA表达水平，ERα mRNA/ERβ mRNA比率为2。结果与蛋白表达结果一致。

图  2  qRT-PCR检测Nthy-ori3-1、BCPAP细胞中ERα和ERβ的mRNA表达

Figure  2.  The mRNA expressions of ERα and ERβ in Nthy-ori3-1 and BCPAP cells detected by qRT-PCR

* P<0.05, vs. Nthy-ori3-1 group (n=3)

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2.3   UHRF1对ERα和ERβ蛋白及mRNA表达影响

见图3。将Scrambled siRNA和UHRF1 siRNA转染入BCPAP细胞后，与空白对照组和Scrambled siRNA组相比，UHRF1 siRNA组细胞ERβ蛋白和mRNA表达水平升高的同时，ERα蛋白和mRNA表达水平降低，导致ERα/ERβ比率降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果说明：UHRF1抑制ERβ表达的同时增加ERα表达，进而上调ERα/ERβ比率。

图  3  3组BCPAP细胞中ERα、ERβ蛋白和mRNA表达

Figure  3.  The protein and mRNA expression levels of ERα and ERβ in 3 groups of BCPAP cells

* P<0.05, vs. control and Scrambled siRNA groups (n=3)

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2.4   UHRF1对BCPAP细胞增殖的影响

将Scrambled siRNA和UHRF1 siRNA转染入BCPAP细胞后，MTT检测到各组细胞增殖率变化，与空白对照组（100%）和Scrambled siRNA组〔（99.67±9.02）%〕相比，UHRF1 siRNA组细胞增殖率〔（79.67±6.11）%〕降低，差异有统计学意义（P<0.05），空白对照组和Scrambled siRNA组差异无统计学意义。结果说明UHRF1促进BCPAP细胞增殖。

2.5   UHRF1对BCPAP细胞侵袭和迁移的影响

与空白对照组和Scrambled siRNA组相比，UHRF1 siRNA组细胞侵袭（图4）和迁移（图5）均降低，差异均有统计学意义（P<0.05），空白对照组和Scrambled siRNA组差异无统计学意义。结果说明UHRF1促进BCPAP细胞侵袭和迁移。

图  4  Transwell检测BCPAP细胞侵袭。 ×200

Figure  4.  The invasion of BCPAP cells detected by Transwell. ×200

* P<0.05, vs. control and Scrambled siRNA groups (n=3)

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图  5  Transwell检测BCPAP细胞迁移。 ×200

Figure  5.  The migration of BCPAP cells detected by Transwell. ×200

* P<0.05, vs. control and Scrambled siRNA groups (n=3)

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3.   讨论

PTC是一种与雌激素相关的内分泌系统肿瘤，经PTC动物模型研究证实雌激素可以促进PTC的发展^[9]；体外研究也表明雌激素对培养的PTC细胞有促增生作用^[10]；这说明雌激素在PTC的发展中起促进作用。雌激素对PTC细胞的作用主要由雌激素受体ERα和ERβ介导，ERα和ERβ由独立不同的基因编码，虽有相似的结构，但在结构上存在一定的差异，使得ERα和ERβ可能具有不同的功能^[11]。我们近期研究成果表明：与雌激素相关的肿瘤如乳腺癌^[12]和卵巢癌^[13]一样，与正常甲状腺组织和细胞比较，ERα在PTC组织和细胞中表达增高，而ERβ表达下降，ERα/ERβ比率显著增高，ERα促进细胞增生、侵袭和转移，与PTC恶性临床病理特征（大肿瘤、包膜浸润、淋巴结转移和高TNM分期）呈正相关，而ERβ抑制细胞增生、侵袭和转移，与PTC的恶性临床病理特征呈负相关，即与乳腺癌和卵巢癌等雌激素相关肿瘤相似，ERα和ERβ在PTC的发展中也表现出相反的作用^[4]。越来越多的研究显示：雌激素信号主要依赖于ERα和ERβ表达水平及其平衡，当促增生的ERα相对于抗增生的ERβ占优势即ERα/ERβ比率上调显著大于1时，就会导致雌激素反应器官肿瘤的发生^[11,13]。

UHRF1基因位于染色体19p13.3，是一种重要的表观遗传学调节因子，可招募表观遗传学标记酶如甲基化转移酶结合到TSG的启动子区，形成抑制性复合体抑制这些TSG的表达，从而参与肿瘤的发生发展过程^[14]。人类基因组数据分析显示：大多数基因的启动子区都具有CpG富集区即CpG岛。启动子区CpG岛低水平或缺乏甲基化与染色质松弛状态有关，有利于DNA与转录复合物相互作用，激活基因表达。相反，基因启动子区CpG岛的高甲基化与染色质紧密状态有关，导致基因表达降低或沉默^[15]。研究表明：在乳腺癌^[16-17]中，DNA甲基化转移酶的表达增高与ERβ基因启动子区CpG岛高甲基化以及ERβ mRNA表达降低或沉默密切相关。本研究中，UHRF1抑制ERβ表达水平，结合文献报道结果说明：在PTC中，UHRF1可能招募DNA甲基化转移酶到ERβ基因启动子区域，下调或沉默ERβ mRNA表达。但是UHRF1对ERβ表达水平的具体调控机制尚需进一步研究。

有研究报道：在乳腺癌细胞中，ERβ对ERα基因表达和启动子活性有抑制作用，ERβ通过与转录因子Sp1相互作用，招募NCoR和SMRT共抑制因子，结合到ERα基因转录起始位点上游启动子GC区而下调ERα的表达^[18]。提示：在乳腺癌等雌激素相关肿瘤的发展中，作为肿瘤抑制基因的ERβ表达逐渐降低，减弱了它对ERα基因表达的抑制作用，使ERα基因表达上调，与ERα/ERβ比率增高密切相关。本研究结果显示：在BCPAP细胞中，UHRF1抑制ERβ表达水平的同时促进ERα表达水平，进而上调了ERα/ERβ表达比率，提示此结果的产生可能是由于上述调控机制所导致。

在本实验中，UHRF1上调了ERα/ERβ表达比率并且也促进了PTC细胞BCPAP增生、侵袭和迁移，分析有以下原因：①UHRF1作为癌基因本身促进BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移；②UHRF1抑制了ERβ表达水平，因ERβ能够显著抑制ERα表达水平，减弱了它对ERα基因表达的抑制作用，使得ERα/ERβ比率增高，促进BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移，PTC细胞BCPAP增殖、侵袭和迁移可能是上述两个机制的综合结果。

综上，调节UHRF1表达可以改变ERα/ERβ表达比率，影响BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移，说明UHRF1有望成为PTC治疗和预后的一个潜在靶点。但UHRF1通过表观遗传学改变ERα/ERβ表达比率的分子调控机制，需要后续更为深入的研究，这些研究将为PTC临床治疗提供更为广阔的前景。