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UHRF1调控雌激素受体表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

许琳婉 张潞渝 苟茜 邱伊波 刘智敏

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栏目: 论  著

UHRF1调控雌激素受体表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

    通讯作者: 刘智敏, liuzm9999@aliyun.com
  • doi: 10.12182/20200560501

Column:  

Effects of UHRF1 on Estrogen Receptor and Proliferation, Invasion and Migration of BCPAP Cells in Thyroid Papillary Carcinoma

    Corresponding author: LIU Zhi-min, liuzm9999@aliyun.com
  • 摘要: 目的 观察泛素样含PDH和环指域1 (UHRF1)对雌激素受体(ER)α和ERβ表达比率的影响,探讨UHRF1影响甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移的机制。 方法 应用Western blot、实时荧光定量(qRT)-PCR检测正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞BCPAP中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白及mRNA表达。分别用Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA处理BCPAP细胞,qRT-PCR检测各组细胞中ERαERβ的mRNA表达;MTT、Transwell分别检测各组细胞增殖、侵袭和迁移。 结果 与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP细胞中UHRF1和ERα蛋白及mRNA表达水平上调(P<0.05),而ERβ蛋白和mRNA表达水平下调(P<0.05)。与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞中ERα mRNA表达降低(P<0.05),ERβ mRNA表达升高(P<0.05);转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移降低(P<0.05)。 结论 UHRF1可上调ERα/ERβ的表达比率,促进甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移。
  • 图 1  Western blot检测Nthy-ori3-1、BCPAP细胞中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白表达

    Figure 1.  The protein expressions of UHRF1, ERα and ERβ in Nthy-ori3-1 and BCPAP cells detected by Western blot

    图 2  qRT-PCR检测Nthy-ori3-1、BCPAP细胞中ERαERβ的mRNA表达

    Figure 2.  The mRNA expressions of ERα and ERβ in Nthy-ori3-1 and BCPAP cells detected by qRT-PCR

    图 3  3组BCPAP细胞中ERα、ERβ蛋白和mRNA表达

    Figure 3.  The protein and mRNA expression levels of ERα and ERβ in 3 groups of BCPAP cells

    图 4  Transwell检测BCPAP细胞侵袭。 ×200

    Figure 4.  The invasion of BCPAP cells detected by Transwell. ×200

    图 5  Transwell检测BCPAP细胞迁移。 ×200

    Figure 5.  The migration of BCPAP cells detected by Transwell. ×200

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-11
  • 录用日期:  2019-12-10
  • 网络出版日期:  2020-05-25
  • 刊出日期:  2020-05-01

栏目: 论  著

UHRF1调控雌激素受体表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

    通讯作者: 刘智敏, liuzm9999@aliyun.com
  • 重庆医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学教研室 分子医学与肿瘤研究中心 (重庆 400016)

摘要:  目的 观察泛素样含PDH和环指域1 (UHRF1)对雌激素受体(ER)α和ERβ表达比率的影响,探讨UHRF1影响甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移的机制。 方法 应用Western blot、实时荧光定量(qRT)-PCR检测正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞BCPAP中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白及mRNA表达。分别用Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA处理BCPAP细胞,qRT-PCR检测各组细胞中ERαERβ的mRNA表达;MTT、Transwell分别检测各组细胞增殖、侵袭和迁移。 结果 与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP细胞中UHRF1和ERα蛋白及mRNA表达水平上调(P<0.05),而ERβ蛋白和mRNA表达水平下调(P<0.05)。与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞中ERα mRNA表达降低(P<0.05),ERβ mRNA表达升高(P<0.05);转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移降低(P<0.05)。 结论 UHRF1可上调ERα/ERβ的表达比率,促进甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移。

English Abstract

Column:  

  • 甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)约占甲状腺癌总数80%,是最常见的一种甲状腺癌[1]。近年来,PTC发病率的增长速度位居女性肿瘤首位[2],目前已知PTC的发生发展会受到激素、遗传、环境等因素的影响[3]。有研究报道,雌激素在PTC的发展中发挥关键作用,而雌激素对PTC细胞的作用主要由雌激素受体(ER)α和ERβ介导,其中ERα表达与细胞异常增殖和恶性肿瘤的发展有关,相反,ERβ可抑制细胞增殖、迁移和侵袭[4]

    泛素样含PDH和环指域1(UHRF1)是与细胞增殖和表观遗传调节相关的多结构域蛋白,是一种众所周知的肿瘤标志物[5]。近年来研究发现UHRF1在乳腺癌[6]、胃癌[7]、宫颈癌[8]等肿瘤中不仅自身表达失调,而且抑制抑癌基因,参与多种肿瘤的增殖、侵袭和迁移等过程。目前,UHRF1在PTC发展中的作用机制尚不清楚。鉴于ERβ在PTC发展中发挥抑癌基因的作用,我们猜测:UHRF1能否调控抑癌基因ERβ表达,进而改变ERα/ERβ表达比率并参与PTC发生发展过程?这种调控机制国内外鲜见报道。

    本研究以人PTC的BCPAP细胞为模型,探讨UHRF1对雌激素受体ERα/ERβ表达和PTC发展的影响,为PTC临床治疗和靶向研究提供更多的理论依据。

    • 胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基购自Gibco公司;胰蛋白酶购自Hyclone公司;RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝胶试剂盒和免疫印迹化学发光剂ECL购自碧云天生物技术有限公司;RNA提取试剂盒和定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司;兔抗人UHRF1和β-actin多克隆抗体购自Bioworld公司;兔抗人ERα和ERβ多克隆抗体购自Abcam公司;Lipofectamine RNAiMAX购自Invitrogen公司;PCR引物、Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA序列由上海生工生物工程有限公司合成;MTT试剂盒购自美国Sigma公司;Transwell小室和Matrigel基质胶购自美国BD公司。

    • 将本实验室保存的人PTC细胞BCPAP和人甲状腺滤泡上皮正常细胞Nthy-ori3-1贴壁培养于含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基,在37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱环境下培养细胞,根据细胞生长状态换液或传代,随后按照Lipofectamine RNAiMAX使用说明书转染对数生长期的BCPAP细胞。转染前一天将BCPAP细胞按3×105/孔接种于6孔板内培养,待细胞融合度达到60%~80%时转染siRNA。UHRF1 siRNA正义链:5′-GUGGCAAGAAUAGCAAGUATT-3′,反义链:5′-UACUUGCUAUUCUUGCCACTT-3′;Scrambled siRNA正义链:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反义链:5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。用无血清无抗生素的RPMI1640培养基稀释 UHRF1 siRNA、Scrambled siRNA和Lipofectamine RNAiMAX,室温静置5 min后,再将两者混匀室温静置20 min,随后将混合溶液加入对应细胞孔并置于37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱环境下培养6 h后,更换含100 mL/L FBS的RPMI1640培养基继续培养48 h后收取细胞。将PTC细胞BCPAP分为空白对照组、Scrambled siRNA组和UHRF1 siRNA组。

    • 用RIPA裂解液和PMSF提取培养48 h后Nthy-ori3-1和BCPAP细胞与转染后的各组细胞总蛋白,测定UHRF1、ERα和ERβ的蛋白浓度。配置分离胶和浓缩胶后,每孔加入30 μg蛋白进行电泳,随后将分离的目的条带电转移到PVDF膜上,50 g/L脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h,PBST洗膜后放入一抗稀释液 4 ℃孵育过夜,PBST洗膜后再将膜放入二抗稀释液37 ℃孵育2 h, PBST洗膜后发光显影,分析实验数据,以目的条带与β-actin灰度值的比值为目的蛋白的相对含量。实验重复3次。

    • 首先用RNA提取试剂盒提取培养48 h后Nthy-ori3-1和BCPAP细胞与转染后的各组细胞总RNA,然后逆转录成cDNA,最后按照SYBR Premix Ex TaqTM说明书进行扩增,引物设计如下:UHRF1上游引物5′-CAGGCAGACAAGCTGTTGG-3′,下游引物:5′-AACAGCTCCTGGATCTTCCG-3′;ERα上游引物:5′-AGCCTCCTGTCTACCGACTC-3′,下游引物:5′-GCAGGAGAAAGGAGCATGGA-3′;ERβ上游引物:5′-TTGACATGCTCCTGGCAACT-3′,下游引物: 5′-GGCCCAGCTGTGTGATTACT-3′;β-actin上游引物:5′-GGAGAAGATGACCCAGATCA-3′,下游引物5′-GATCTTCATGAGCTAGTCAG-3′。所有基因均使用β-actin为内参,实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成,实验重复3次,用公式2ΔΔCt计算基因相对表达量。

    • 将对数生长期的BCPAP细胞,经胰酶消化后制成单细胞悬液,以5×103/孔的细胞数接种于96孔板,培养于37 ℃、体积分数为5%CO2孵育箱中,孵育24 h;细胞贴壁后分组处理细胞,继续培养48 h,每孔加入20 μL MTT (5 mg/mL)继续培养4 h。终止培养弃去培养液,每孔加入150 μL DMSO,充分溶解,震荡10 min,显色,570 nm处测定每孔吸光度值,以空白对照组细胞活力为100%,计算各组细胞增殖率,公式:增殖率=(实验组值-空白孔组值)/(空白对照组值-空白孔组值)×100%。实验重复3次。

    • 侵袭实验:无血清RPMI1640培养基按8∶1稀释Matrigel胶后,在Transwell小室上室中每孔均匀铺入60 μL,小室放于24孔培养板中,37 ℃孵育1 h。转染24 h后收集空白对照组、Scrambled siRNA组和UHRF1 siRNA组的细胞。按1×105/孔细胞密度接种于上室,并加入100 μL RPMI1640无血清培养基,将600 μL含100 mL/L FBS的RPMI1640培养基加入下室。37 ℃孵箱培养24 h后甲醇固定30 min,1 g/L结晶紫染色10 min,计数200倍光镜下随机选取的5个视野的细胞数目,实验重复3次。

      迁移实验:在实验中不铺Matrigel胶,取出在37 ℃、体积分数为5%CO2环境下培养24 h后的小室,其余步骤与侵袭实验一致。

    • 实验数据以$\bar x$ ± s表示。组间比较采用t检验、单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

    • 图1。与Nthy-ori3-1细胞比较,BCPAP细胞中的UHRF1和ERα的蛋白表达水平增高,而ERβ蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。在Nthy-ori3-1细胞中,ERα蛋白表达水平明显低于ERβ蛋白表达水平,ERα/ERβ蛋白比率为0.44,而在BCPAP细胞中,ERα蛋白表达水平高于ERβ蛋白表达水平,ERα/ERβ蛋白比率为2.37。

      图  1  Western blot检测Nthy-ori3-1、BCPAP细胞中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白表达

      Figure 1.  The protein expressions of UHRF1, ERα and ERβ in Nthy-ori3-1 and BCPAP cells detected by Western blot

    • 图2。BCPAP细胞中UHRF1 mRNA表达水平(16.91±1.59)高于Nthy-ori3-1细胞(6.36±0.73)。与Nthy-ori3-1细胞比较,BCPAP细胞中ERα mRNA表达水平增高,而ERβ mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在Nthy-ori3-1细胞中,ERα mRNA表达水平明显低于ERβ mRNA表达水平,ERα mRNA/ERβ mRNA比率为0.35,而在BCPAP细胞中,ERα mRNA表达水平明显高于ERβ mRNA表达水平,ERα mRNA/ERβ mRNA比率为2。结果与蛋白表达结果一致。

      图  2  qRT-PCR检测Nthy-ori3-1、BCPAP细胞中ERαERβ的mRNA表达

      Figure 2.  The mRNA expressions of ERα and ERβ in Nthy-ori3-1 and BCPAP cells detected by qRT-PCR

    • 图3。将Scrambled siRNA和UHRF1 siRNA转染入BCPAP细胞后,与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,UHRF1 siRNA组细胞ERβ蛋白和mRNA表达水平升高的同时,ERα蛋白和mRNA表达水平降低,导致ERα/ERβ比率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结果说明:UHRF1抑制ERβ表达的同时增加ERα表达,进而上调ERα/ERβ比率。

      图  3  3组BCPAP细胞中ERα、ERβ蛋白和mRNA表达

      Figure 3.  The protein and mRNA expression levels of ERα and ERβ in 3 groups of BCPAP cells

    • 将Scrambled siRNA和UHRF1 siRNA转染入BCPAP细胞后,MTT检测到各组细胞增殖率变化,与空白对照组(100%)和Scrambled siRNA组〔(99.67±9.02)%〕相比,UHRF1 siRNA组细胞增殖率〔(79.67±6.11)%〕降低,差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组和Scrambled siRNA组差异无统计学意义。结果说明UHRF1促进BCPAP细胞增殖。

    • 与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,UHRF1 siRNA组细胞侵袭(图4)和迁移(图5)均降低,差异均有统计学意义(P<0.05),空白对照组和Scrambled siRNA组差异无统计学意义。结果说明UHRF1促进BCPAP细胞侵袭和迁移。

      图  4  Transwell检测BCPAP细胞侵袭。 ×200

      Figure 4.  The invasion of BCPAP cells detected by Transwell. ×200

      图  5  Transwell检测BCPAP细胞迁移。 ×200

      Figure 5.  The migration of BCPAP cells detected by Transwell. ×200

    • PTC是一种与雌激素相关的内分泌系统肿瘤,经PTC动物模型研究证实雌激素可以促进PTC的发展[9];体外研究也表明雌激素对培养的PTC细胞有促增生作用[10];这说明雌激素在PTC的发展中起促进作用。雌激素对PTC细胞的作用主要由雌激素受体ERα和ERβ介导,ERα和ERβ由独立不同的基因编码,虽有相似的结构,但在结构上存在一定的差异,使得ERα和ERβ可能具有不同的功能[11]。我们近期研究成果表明:与雌激素相关的肿瘤如乳腺癌[12]和卵巢癌[13]一样,与正常甲状腺组织和细胞比较,ERα在PTC组织和细胞中表达增高,而ERβ表达下降,ERα/ERβ比率显著增高,ERα促进细胞增生、侵袭和转移,与PTC恶性临床病理特征(大肿瘤、包膜浸润、淋巴结转移和高TNM分期)呈正相关,而ERβ抑制细胞增生、侵袭和转移,与PTC的恶性临床病理特征呈负相关,即与乳腺癌和卵巢癌等雌激素相关肿瘤相似,ERα和ERβ在PTC的发展中也表现出相反的作用[4]。越来越多的研究显示:雌激素信号主要依赖于ERα和ERβ表达水平及其平衡,当促增生的ERα相对于抗增生的ERβ占优势即ERα/ERβ比率上调显著大于1时,就会导致雌激素反应器官肿瘤的发生[11,13]

      UHRF1基因位于染色体19p13.3,是一种重要的表观遗传学调节因子,可招募表观遗传学标记酶如甲基化转移酶结合到TSG的启动子区,形成抑制性复合体抑制这些TSG的表达,从而参与肿瘤的发生发展过程[14]。人类基因组数据分析显示:大多数基因的启动子区都具有CpG富集区即CpG岛。启动子区CpG岛低水平或缺乏甲基化与染色质松弛状态有关,有利于DNA与转录复合物相互作用,激活基因表达。相反,基因启动子区CpG岛的高甲基化与染色质紧密状态有关,导致基因表达降低或沉默[15]。研究表明:在乳腺癌[16-17]中,DNA甲基化转移酶的表达增高与ERβ基因启动子区CpG岛高甲基化以及ERβ mRNA表达降低或沉默密切相关。本研究中,UHRF1抑制ERβ表达水平,结合文献报道结果说明:在PTC中,UHRF1可能招募DNA甲基化转移酶到ERβ基因启动子区域,下调或沉默ERβ mRNA表达。但是UHRF1对ERβ表达水平的具体调控机制尚需进一步研究。

      有研究报道:在乳腺癌细胞中,ERβ对ERα基因表达和启动子活性有抑制作用,ERβ通过与转录因子Sp1相互作用,招募NCoR和SMRT共抑制因子,结合到ERα基因转录起始位点上游启动子GC区而下调ERα的表达[18]。提示:在乳腺癌等雌激素相关肿瘤的发展中,作为肿瘤抑制基因的ERβ表达逐渐降低,减弱了它对ERα基因表达的抑制作用,使ERα基因表达上调,与ERα/ERβ比率增高密切相关。本研究结果显示:在BCPAP细胞中,UHRF1抑制ERβ表达水平的同时促进ERα表达水平,进而上调了ERα/ERβ表达比率,提示此结果的产生可能是由于上述调控机制所导致。

      在本实验中,UHRF1上调了ERα/ERβ表达比率并且也促进了PTC细胞BCPAP增生、侵袭和迁移,分析有以下原因:①UHRF1作为癌基因本身促进BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移;②UHRF1抑制了ERβ表达水平,因ERβ能够显著抑制ERα表达水平,减弱了它对ERα基因表达的抑制作用,使得ERα/ERβ比率增高,促进BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移,PTC细胞BCPAP增殖、侵袭和迁移可能是上述两个机制的综合结果。

      综上,调节UHRF1表达可以改变ERα/ERβ表达比率,影响BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移,说明UHRF1有望成为PTC治疗和预后的一个潜在靶点。但UHRF1通过表观遗传学改变ERα/ERβ表达比率的分子调控机制,需要后续更为深入的研究,这些研究将为PTC临床治疗提供更为广阔的前景。

参考文献 (18)

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